不同線栓法復制局灶性腦缺血模型大鼠恢復期學習記憶能力的差異及其機制

繆培，張通，米海霞，張偉東

1.首都醫科大學附屬北京潞河醫院，北京市 101199；2.中國康復研究中心北京博愛醫院，北京市 100068；3.首都醫科大學康復醫學院，北京市 100068；4.國家衛生健康委員會保健局，北京市 100044

0 引言

腦卒中是最常見的嚴重神經系統疾病，約88%是缺血性腦卒中。實驗動物模型為研究缺血性腦卒中的病理生理過程提供了重要手段[1]。

大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlu‐sion,MCAO)模型是目前最常用的模擬人類腦梗死的實驗動物模型。制備MCAO模型的方法很多，如光化學法、三氯化鐵法、線栓法、自體血栓法、電流損傷法、自發性MCAO 等[2]。Zea Longa 線栓法[3]具有不開顱、效果肯定、可準確控制缺血時間等優點，是目前應用最廣泛的方法。根據線栓保留時間，可分為永久性腦缺血模型和腦缺血再灌注模型，分別模擬沒有再灌注的腦梗死和血管再通的腦梗死[4]。探討不同模型大鼠功能預后，對選擇實驗動物模型十分重要。

既往比較不同MCAO大鼠模型間差異的研究主要集中于急性期，觀察指標局限在梗死體積和病理生理方面[5-9]。腦梗死會出現長期感覺運動功能和認知功能障礙，慢性期的研究也非常重要；對實驗性腦梗死動物模型長期預后的研究主要集中于感覺運動和認知功能方面[10]。也有學者探討不同MCAO 模型間恢復期差異，主要集中于行為學方面，且均非線栓法[11-12]。

局灶性腦缺血大鼠存在自發恢復[13]，探討腦梗死動物模型在自發恢復過程中的認知功能變化，對評估藥物或康復策略的長期效果很有必要。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)利用水分子在不均質組織中的擴散具有各向異性特征進行成像，最常用的參數是各向異性分數(fractional anisot‐ropy,FA)[14]。

本研究比較永久性缺血和缺血再灌注大鼠模型在自然恢復狀態下認知功能恢復的差異，并分析DTI 相應感興趣腦區的FA，為選取理想的局灶性腦缺血大鼠模型進行相關實驗研究提供參考；同時探討功能恢復與腦結構變化的關系，為預測腦梗死功能恢復提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠21 只，體質量250～280 g，SPF 級，飼養于北京友誼醫院實驗動物部動物屏障實驗室，許可證號SYXK(京)2012-0023。

本研究已經首都醫科大學動物試驗倫理審核(No.AEEI-2014-132)。

1.2 模型制備

將大鼠隨機分為假手術組(n=7)、永久性缺血組(n=7)和缺血再灌注組(n=7)。禁食水12 h。

永久性缺血組以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺上，頸部正中切口，鈍性分離暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分岔處，結扎頸總動脈及頸外動脈近心端，動脈夾臨時夾閉頸內動脈，于頸總動脈遠心端做一切口，插入相應直徑的硅膠頭線栓，使其沿頸總動脈進入頸內動脈，到達大腦中動脈起始部，有輕微阻力感時停止，深約1.8～2.0 cm。固定線栓，檢查無出血后縫合切口。每天皮下注射生理鹽水5 mL補液，連續3 d。

缺血再灌注組基本操作同永久性缺血組，插入線栓后開始計時；固定線栓，縫合頸部皮膚，使栓線尾端暴露于皮膚外；90 min 后再次麻醉大鼠，拆除頸部皮膚縫合線，拔出栓線；縫合頸部皮膚。

假手術組僅暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分岔處后，縫合切口。

手術過程中保持室溫＞25 ℃。術后予電熱毯保暖，維持肛溫(37±0.5)℃。予充足的食物和水。

1.3 納入標準

造模后參照Longa 評分標準[3]評分：0 分，無神經功能損傷癥狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向對側轉圈；3 分，向對側傾倒；4 分，不能自發行走；5分，意識喪失。1～3分納入實驗。所有大鼠均納入。

1.4 Morris水迷宮

Morris 水迷宮(安徽正華生物儀器設備有限公司)直徑170 cm，高50 cm，水池內壁漆為黑色，水溫(23±1)℃。室內光照恒定，無光線反射在池內。將水池分為四個象限，第一象限正中距離池壁35 cm 處放直徑9 cm、高35 cm 的圓形平臺，平臺頂低于水面1 cm，水池中倒入墨水掩蓋平臺。水迷宮上方攝像機同步記錄大鼠運動軌跡。訓練期間，水迷宮外參照物保持不變。

1.4.1 定位航行實驗

大鼠從術后16 d 開始，于每天上午8:00～11:00 訓練4 次，共6 d。依次選擇4 個象限作為入水點，將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓練所有大鼠入水點相同。如大鼠在水中游泳一段時間后爬上站臺，并在站臺上停留時間超過3 s，認為大鼠找到站臺，系統記錄大鼠在水中游泳時間，為逃避潛伏期。如大鼠90 s 內未找到平臺，人為將其引導上平臺，潛伏期記為90 s；大鼠爬上平臺或被引導上平臺后，讓其在平臺上休息10 s。取四次訓練的平均值。第1 天訓練為適應性訓練，不計入統計。

1.4.2 空間探索實驗

訓練第7天(術后22 d)撤除平臺，將大鼠從第三象限面向池壁放入水中120 s。記錄其第一次到達平臺所在位置時間(潛伏期)，在各象限的游泳路程、時間、速度，以及大鼠在站臺周圍活動路程、時間、游泳路徑。計算平臺象限與邊界游泳路程比和時間比。

1.5 DTI

術后22 d，各組選Longa 評分相近的4 只大鼠，采用PharmaScan 7.0 T MRI 掃描儀(德國BRUKER BIOSPIN 公司)進行掃描，包括定位圖、T2WI、T2map及DTI。定位圖采用RARE序列，層厚1 mm，掃描層數8 層，TR 2000 ms，TE 32.2 ms，偏轉角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；T2WI 采用RARE 序列，層厚0.7 mm，掃描層數30 層，TR 5000 ms，TE 36 ms，偏轉角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；DTI 采用SE-EPI 序列，彌散敏感梯度為非共線且非共面的30 個梯度方向，b=1000 s/mm2，同時包括5 個b=0 s/mm2的DTI 圖像，層厚0.7 mm，掃描層數30 層，TR 7500 ms，TE 25 ms，偏轉角90°，視野330×330 mm，矩陣256×256，相位編碼方向為從左到右，平均激勵次數4次。

數據由同一實驗人員在工作站采集，選T2WI 顯示缺血灶面積最大的層面，在病灶側選缺血皮質區和紋狀體區面積1 mm2的感興趣區；以冠狀位為軸，在對側相應位置取相同面積感興趣區。測定感興趣區FA，計算病灶側與對側比值(rFA)。

選T2WI海馬層面，選取病灶側海馬區面積1 mm2感興趣區，以冠狀位為軸，在對側相應位置取相同面積感興趣區。測定感興趣區FA，計算rFA。

采用Image J 軟件分別劃取大鼠各層面腦梗死區域，計算腦梗死體積和梗死體積比。

1.6 統計學分析

采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以()表示，若符合正態分布且方差齊，則采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗；若不符合正態分布，則采用秩和檢驗；多組重復測量數據比較采用重復測量方差分析。大鼠感興趣區有顯著性差異的DTI參數與有顯著性差異的認知功能相關指標行Spearman相關分析。顯著性水平，秩和檢驗采用校正α=0.017，其余檢驗α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 定位航行實驗

三組逃避潛伏期均隨訓練時間增加呈下降趨勢，永久性缺血組無顯著性差異(P＞0.05)，但永久性缺血組第3天、第5天時潛伏期小于第1天(P＜0.05)。

組間比較，永久性缺血組各時間點逃避潛伏期均大于假手術組和缺血再灌注組(P＜0.05)。缺血再灌注組與假手術組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組定位航行實驗逃避潛伏期比較 單位：s

2.1.2 空間探索實驗

三組平臺象限時間比、距離比無顯著性差異(P＞0.017)；永久性缺血組和缺血再灌注組邊界時間比和距離比大于假手術組(P＜0.017)，永久性缺血組潛伏期大于假手術組(P＜0.017)。三組平均速度值無顯著性差異(P＞0.017)。見表2。

2.1.3 游泳路徑

假手術組和缺血再灌注組探索軌跡趨向性、目的性更強，主要集中于水池內部，永久性缺血組路徑集中于周邊。見圖1。

圖1 三組游泳路徑

2.2 DTI

2.2.1 皮質

皮質左側(患側)FA 和rFA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術組(P＜0.05)。三組間右側FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 三組皮質感興趣區FA及rFA值比較

2.2.2 紋狀體

紋狀體左側FA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術組(P＜0.05)。rFA 由小到大依次為永久性缺血組=缺血再灌注組＜假手術組(P＜0.05)。三組間右側FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

2.2.3 海馬

三組間海馬左側、右側FA和rFA均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 三組海馬感興趣區FA及rFA值比較

2.2.4 梗死體積

永久性缺血組梗死體積和梗死體積比明顯大于缺血再灌注組(P＜0.01)。見表6。

表6 兩組梗死體積比較

2.3 相關性分析

逃避潛伏期、邊界時間比和距離比與皮質和紋狀體左側FA、rFA 均相關(P＜0.05)。水迷宮測試的潛伏期和邊界時間比與梗死體積和梗死體積比均相關(P＜0.05)。見表7。

表7 DTI參數與Morris水迷宮相關參數的相關性分析

3 討論

Morris 水迷宮是用來評定局灶性腦缺血大鼠空間學習能力和記憶能力的常用方法[15-17]，逃避潛伏期代表動物空間學習能力。本研究顯示，永久性缺血模型和缺血再灌注模型大鼠學習能力均有損傷，缺血再灌注大鼠損傷較輕。

空間探索實驗中，大鼠尋找平臺所在位置的游泳策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的指標。正常大鼠隨著訓練次數增加，游泳軌跡更有趨向性和直線性，目的性較強，而癡呆大鼠可能更趨向于邊緣性和隨機性。本研究顯示，永久性缺血模型大鼠游泳路徑屬典型的邊緣式，提示認知損傷較重。三組大鼠平均速度基本相同，可排除速度對結果的影響。與Roof等[11]的結果一致，永久性腦缺血大鼠學習記憶能力損傷持久而嚴重。

DTI 通過改變擴散敏感梯度方向，測量體素內水分子在各個方向上的擴散強度[14]，FA指各向異性部分與總擴散張量之比[18]，主要反映腦組織神經纖維的多少、排列方向的一致性及纖維束完整性，可用于評價組織結構完整性、病理改變及組織結構和功能關系[19],臨床應用最為廣泛。

大鼠MCAO模型造成紋狀體及額頂顳葉、部分枕葉等區域損傷，丘腦、下丘腦、黑質等部位也會出現不同程度損傷[20-21]。腦梗死后，由于梗死區白質和灰質結構小梁破壞，急性期和亞急性期FA 減小[22]。慢性期，FA 可能增加，可能與運動和神經功能恢復有關；也可能隨著缺血持續，血管源性水腫、細胞膜碎裂、細胞壞死，結構小梁破壞，導致FA 持續降低[23]。本實驗中模型大鼠患側皮質、紋狀體區FA和rFA均明顯下降，可能反映皮質、紋狀體區細胞結構和髓鞘結構的破壞，神經纖維完整性降低；缺血再灌注大鼠患側皮質、紋狀體區FA、rFA 較永久性缺血大鼠增高，可能與再灌注大鼠早期恢復血流，半暗帶血供改善，細胞壞死減輕有關[24]。右側皮質、紋狀體區FA 和rFA均無顯著性差異，提示對側皮質纖維結構無明顯損傷。

本實驗中，三組大鼠雙側海馬區FA、rFA 均無顯著性差異，主要由于海馬的血供主要是由大腦后動脈分支供應，少部分由頸內動脈發出的脈絡膜前動脈供應，因此MCAO 并不會引起海馬缺血改變[25]。有研究顯示[26]，海馬改變可能與腦梗死后，周圍皮質形成的擴散性抑制波有關：擴散性抑制波會引起皮質釋放過量谷氨酸，過量的谷氨酸順突觸傳遞到同側海馬，引起同側海馬神經元興奮性中毒和環氧化酶2 升高，進而引起海馬炎癥反應和神經元凋亡。海馬與學習記憶能力密切相關[27]。兩種模型大鼠均出現與海馬相關的學習記憶能力受損，可能與海馬區炎癥反應和神經元凋亡有關，也可能與皮質、紋狀體區與海馬區之間的神經通路受損有關[28]。有研究顯示[29]，皮質或紋狀體損傷與Morris 水迷宮學習記憶能力受損有關，與本研究一致。

缺血側大腦半球距嗅球尖端7～11 mm 矢狀裂至外側裂下2/3 皮質組織僅由大腦中動脈供血，大鼠MCAO 模型時梗死出現早而完全，可代表缺血中心區；上1/3 皮質組織由大腦前動脈和中動脈雙重供血，缺血較輕，表現為半暗帶變化[30]；缺血再灌注后主要恢復半暗帶區血流，在灌注時間窗內恢復血流可減少梗死體積。缺血后恢復再灌注時間越長，梗死體積越大[31]。本研究顯示，缺血再灌注大鼠梗死體積較永久性腦缺血大鼠縮小，與既往研究結果一致[31-32]。

相關性分析顯示，學習記憶能力與腦梗死大鼠患側皮質、紋狀體區FA、rFA 相關，這與湯翔宇等[33]的研究一致。有學者認為，腦梗死體積與大鼠神經功能缺損有一定相關性，可將梗死體積變化作為評估大鼠預后的指標[24,32]。

綜上所述，永久性腦缺血和缺血再灌注模型大鼠均會出現學習記憶功能障礙，可能與缺血區神經纖維結構破壞、缺血區血管源性水腫，以及皮質、紋狀體區與海馬未缺血區纖維聯系斷裂等相關。嚴重的認知功能障礙只出現在永久性腦缺血大鼠模型中，缺血再灌注大鼠認知功能損傷較輕，可能與缺血皮質、紋狀體區神經纖維結構更加完整、梗死體積更小有關。恢復期腦損傷區域FA 增加、梗死體積變小，可能為功能恢復良好的有效預測指標。

本研究樣本量偏小，還需進一步研究驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。