具有區分力的葉酸片體外溶出度測定方法研究

陳倩倩 ，劉正平 ，劉藝盈，毛楷凡 ，楊雪華 ，李大偉 ,

（1. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101；2. 國家藥品監督管理局藥物制劑技術研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101；3. 中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 211198；4. 山東福瑞達醫藥集團有限公司山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101）

葉酸是一種水溶性維生素，因綠葉中含量十分豐富而得名，又名蝶酰谷氨酸。在自然界中有幾種存在形式，其母體化合物是由喋啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結合而成。葉酸為黃色結晶[1-2]，微溶于水，但其鈉鹽極易溶于水，不溶于乙醇；在酸性環境中易被破壞，對光、熱也不穩定。

葉酸在體內的吸收部位主要為小腸上部，吸收后的葉酸存在于腸壁、肝、骨髓等組織中，在還原型輔酶II（NADPH）參與下被葉酸還原酶還原成具有生理活性的四氫葉酸，參與嘌呤、嘧啶的合成。該藥屬生物藥劑學分類系統（biopharmaceutics classification system，BCS）中的III/IV類藥物，即低滲透性藥物，臨床主要用于各種原因引起的葉酸缺乏及葉酸缺乏所致的巨幼紅細胞貧血等。葉酸片（5 mg）原研廠家為法國賽諾菲公司（商品名：Speciafoldine）。根據原國家食品藥品監督管理總局公布的第一批可豁免或簡化生物等效性（BE）試驗的品種目錄，5 mg規格的葉酸片可豁免BE試驗，采用體外評價的方法進行一致性評價。

口服固體制劑的體外評價方法主要是體外溶出度的測定[3-8]。溶出度試驗是考察藥品內在質量的有效方法，同時可驗證仿制藥與參比制劑的質量一致性及處方工藝的一致性、合理性[9-11]。在臨床試驗研究成本不斷攀升的背景下，采用有區分力的溶出曲線來剖析制劑的內在質量，無疑是提高生物等效性試驗通過率的最有效和經濟的手段[12-14]。本文以葉酸片為模型藥物，采用紫外分光光度法檢測葉酸含量，測定自制制劑與參比制劑在不同pH溶出介質（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）中的溶出度，并使用相似因子（f2）法進行溶出曲線的相似性評價，以期為葉酸片仿制藥質量一致性評價和處方開發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

860DL自動溶出儀（美國Logan公司）；S40型pH酸度計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Agilent 8454紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；MS204TS/02電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；金怡SHA-2水浴振蕩器（金壇市醫療儀器廠）。

1.2 試藥

葉酸原料藥（河北冀衡藥業有限公司，批號：16050190）；葉酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100074-201715，含量：92.6 %）；葉酸參比制劑Speciafoldine（規格5 mg/片，批號：18FA098）；自制葉酸片（規格5 mg/片，山東省藥學科學院）；磷酸二氫鉀，乙酸鈉，氫氧化鈉，冰乙酸，鹽酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 葉酸供試品溶液的配制 取自制葉酸片，參考《中國藥典》2020年版二部中葉酸片溶出度檢查項方法[15]，分別以0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質（介質體積為900 ml），轉速為75 r/min，溫度（37 ℃），分別于各時間點取樣，補液10 ml，取出的溶出液經0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.2 葉酸對照品溶液的配制 精密稱取葉酸對照品約10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2 不同pH介質中溶解度的測定

按國家藥品監督管理局發布的《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》 中“溶出介質配制方法”[16]，配制pH分別為1.0，2.0，3.5，4.5，5.0，5.5，6.0，6.8，7.8 的溶出介質。取過量的葉酸原料藥，置 25 ml量瓶中，分別加入以上溶出介質，超聲30 min 后置搖床中，37 ℃振蕩 24 h，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，照紫外-可見分光光度法，在281 nm處測定吸光度。計算不同 pH介質中葉酸的溶解度，繪制葉酸在不同pH值條件下的溶解度曲線。見圖1。

圖1 葉酸的pH值-溶解度曲線

由圖1可見，葉酸的溶解度呈明顯的pH依賴性。隨著pH值的升高，葉酸的溶解度增大。即在酸性環境中難溶，在堿性環境中易溶。

2.3 不同pH溶液中穩定性的測定

精密稱取葉酸原料藥適量，置100 ml量瓶中，加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解并定容，搖勻，作為葉酸原料藥貯備液。分別用不同介質（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）對葉酸原料藥貯備液進行逐級稀釋，使葉酸質量濃度約為 5 μg/ml，分別于 0，1，2，4，8 h 取樣，按紫外-可見分光光度法在281 nm處測定吸光度。考察葉酸在不同溶出介質中的穩定性。結果見表1。

表1 葉酸在不同pH溶液中的穩定性

結果表明，測定濃度下，葉酸在pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液中8 h內穩定性良好，但在0.1 mol/L鹽酸溶液中穩定性相對較差，隨放置時間的延長其吸光度呈線性減小趨勢。

2.4 溶出曲線測定方法

取參比制劑或自制制劑12片，照溶出度檢查（《中國藥典》2020年版四部通則0931第二法）[17]，采用槳法，溶出介質（0.1 mol/l鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）經超聲脫氣處理，介質體積為900 ml，轉速為75 r/min，水溫為37 ℃，依法操作，在規定的時間點取溶液10 ml（同時補充10 ml 溶出介質），過0.45 μm濾膜濾過，取濾液，照紫外-可見分光光度法，在281 nm處測定吸光度，按下式計算每片溶出度。

式中，A為供試品溶液的吸光度；Wt為對照品質量；S為供試品溶液的稀釋倍數；At為對照品溶液的吸光度；W為供試品標示量；St為對照品溶液的稀釋倍數。

2.5 溶出曲線測定方法優化

2.5.1 試驗裝置 對于葉酸片，《日本藥典》第17版（JP17）中推薦槳法，《中國藥典》2020年版推薦籃法，因此對不同溶出裝置進行了考察。取葉酸片的參比制劑，分別采用籃法、槳法測定其在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出度。結果見圖2。在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，槳法的溶出呈緩慢上升趨勢，直至全部溶出。而籃法5 min時基本已全部溶出且達平臺期，溶出速率過快，無法反應參比制劑溶出過程中的質量特性。且參比制劑處方中含磷酸氫鈣，密度大，易沉積，籃法不適用于本品溶出曲線研究。最終確定為槳法。

圖2 采用籃法和槳法測定的葉酸片在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線

2.5.2 溶出轉速的選擇 溶出曲線研究和對比過程中應采用較緩和的轉速，使溶出方法具有更好的區分能力。本文采用槳法，以pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液900 ml作為溶出介質，不同時間點取樣10 ml，照紫外-可見分光光度法檢測各樣品溶液和對照品溶液的吸光度，按下式計算累積溶出度。根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》[18]中“普通片劑槳法溶出轉速應從低轉速開始篩選”要求，以轉速 50，75 r/min 進行篩選，測定參比制劑 （Speciafoldine?）的溶出曲線。

式中，Cn為各時間點取出的樣品溶液濃度；L為制劑標示量；V1為各時間點固定的取樣體積；V2為溶出介質體積。

結果見圖3。由圖3可見，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，轉速75 r/min時，15 min已全部溶出并達到平臺期，溶出速率較快；在pH 5.0醋酸鹽緩沖液中，轉速75 r/min時，120 min全部溶出且達到平臺期。轉速降到50 r/min時，兩種介質中溶出明顯減慢，且溶出杯底部有堆積，以至于在試驗時間內未達到溶出平臺，無法反應參比制劑溶出過程中的質量特性。因此溶出轉速選擇75 r/min。

圖3 葉酸片在不同轉速下的溶出曲線

2.5.3 溶出介質的選擇 參照《中國藥典》2020年版二部葉酸片溶出度測定方法[15]、《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》[18]及葉酸在不同pH溶液中穩定性，葉酸溶解度呈pH相關性，溶液pH對片劑溶出度的影響較大。因此在固體制劑常用的溶出介質基礎上（0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水）增加了pH 5.0醋酸鹽緩沖液。葉酸在pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中8 h內穩定性良好；在0.1 mol/L鹽酸溶液中穩定性相對較差，隨放置時間的延長其吸光度呈線性減小趨勢，但在此介質中，可評估自制制劑與參比制劑在酸性環境中的降解情況。因各地水質存在差異會引起pH值變化，故未選擇水作為葉酸片的溶出介質。因此，最終確定0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液做為溶出介質進行溶出曲線相似性評價。

2.6 有區分力的溶出條件確定

參考《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，采用槳法，轉速75 r/min，以0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液作為溶出介質，測定并繪制參比制劑在各溶出條件下的溶出曲線，從中篩選出符合有區分力的溶出條件。

結果見圖4。由圖4可見，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，葉酸溶解度較高，葉酸片溶出較快，難以體現自制片劑與參比制劑的差異。在0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液或pH 5.0醋酸鹽緩沖液中，葉酸溶解度較低，可篩選適宜的具有區分力的溶出條件。4種溶出介質中葉酸參比制劑的溶出曲線差異明顯，其中符合45～60 min釋放達85 %或90～120 min達85 %，且溶出曲線無拐點和突釋的溶出介質為pH 5.0醋酸鹽緩沖液。因此溶出介質確定為pH 5.0醋酸鹽緩沖液。

圖4 葉酸片在不同溶出介質中的溶出曲線

綜上，確定具有區分力的溶出條件為：槳法，轉速75 r/min，以pH 5.0醋酸鹽緩沖液900 ml為溶出介質。

2.7 采用有區分力的溶出條件篩選葉酸片處方

以不同處方制備葉酸片（A、B、C），以市售的葉酸原研片作為參比制劑，以2.6項下具有區分力的溶出條件對葉酸片處方進行篩選。溶出曲線見圖5。采用相似因子（f2）法比較溶出曲線相似性，當兩條溶出曲線相似因子（f2）數值不小于50時，可認為溶出曲線相似。制備處方以所得溶出曲線與參比制劑相似者，即f2因子數值最大者為佳。

圖5 葉酸自制片與參比制劑在具區分力條件下的溶出曲線

表2 葉酸自制片處方要點及相應f2因子

由結果可知，不同處方制備的葉酸片在具有區分力的溶出條件下溶出曲線與參比制劑相似，相似因子f2均大于50，且隨著處方中原料藥與磷酸氫鈣的比值不同，相似因子f2也發生變化。當采用處方B時，f2數值最大且最佳。因此，采用pH 5.0醋酸鹽緩沖液為溶出介質，對葉酸片的處方工藝有區分力。

2.8 溶出度測定方法學驗證

2.8.1 專屬性實驗 根據自制制劑的處方比例，制成不含主藥的空白輔料樣品 （約相當于5 mg規格的葉酸片輔料量）。加pH 6.8磷酸鹽緩沖液25 ml溶解，并用pH 5.0醋酸鹽緩沖液25 ml稀釋成空白輔料溶液；另精密稱取葉酸對照品適量，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。過濾，取續濾液，分別對葉酸對照品溶液和空白輔料溶液按照紫外-可見分光光度法在281 nm處測定吸光度，紫外吸收光譜圖見圖6。結果證明空白輔料在281nm處無吸收，該方法專屬性良好。

圖6 葉酸專屬性紫外吸收光譜圖

2.8.2 線性試驗 精密稱取葉酸對照品適量，置100 ml量瓶中，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液溶解至刻度，搖勻，精密量取 0.5，1，2，5，8，10 ml，分別置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，制成葉酸質量濃度（C）分別為 0.689，1.377，2.754，6.885，11.016，13.771 μg/ml的系列溶液；分別取上述系列溶液，照紫外-可見分光光度法，在281 nm處測定吸光度。以C為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得線性方程為Y=0.0600x+0.0024，相關系數r2為1.0000。表明葉酸片在0.689～13.771 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.8.3 精密度 分別取線性試驗項下濃度為6.885 μg/ml的對照品溶液，連續測定6次，濃度平均值為6.903 μg/ml，RSD為0.01 %，說明精密度良好。

2.8.4 濾膜吸附性 取濃度為 6.885 μg/ml的葉酸對照溶液，用 0.45 μm微孔濾膜過濾，分別取過濾前溶液及5，10，15，20，25，30，40，50，60 ml濾液，照紫外-可見分光光度法，在281 nm處測定吸光度（A），A的RSD為0.82 %，表明濾膜對葉酸無吸附。

2.8.5 回收率試驗 精密稱取葉酸對照品適量，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液超聲溶解至刻度，搖勻， 作為對照品貯備液。精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別精密量取對照品貯備液3，5，7 ml各3份，分別置9個100 ml量瓶中，加空白輔料約95 mg，加pH 5.0醋酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取對照品溶液及供試品溶液各適量，照紫外-可見分光光度法，在281 nm處測定吸光度，計算回收率。結果顯示，平均回收率為100.41 %，RSD為0.64 %，結果表明，方法準確度良好。

以上溶出度方法學驗證指標均滿足要求，提示建立的溶出度檢查方法可行。

2.9 自制制劑與參比制劑溶出對比

參照《普通口服固體制劑溶出度實驗技術指導原則》[18]，采用非模型依賴法中的相似因子（f2）法[19]比較自制制劑與參比制劑在0.1 mol/L鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 5.0醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線相似性。按下式計算相似因子值。結果見圖7。

圖7 葉酸自制制劑和參比制劑在不同溶出介質中的溶出曲線

式中，Rt為t時間參比樣品平均溶出量；Tt為t時間受試樣品平均溶出量；n為取樣時間點的個數。

由圖7可見，葉酸片自制制劑與參比制劑在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，15 min溶出度大于85 %，在其他3種介質中，f2值均大于50。說明自制制劑與參比制劑在4種溶出介質中的溶出行為相似。

3 討論與結論

在口服固體制劑質量評價中，最為有效的手段是建立能體現參比制劑內在質量、具有區分力的溶出曲線。本研究通過篩選試驗裝置、溶出轉速、溶出介質等，確定葉酸片具有區分力的溶出條件：槳法，最佳轉速為75 r/min，pH 5.0醋酸鹽緩沖液作為溶出介質。此條件下，藥物的溶出曲線呈明顯的上升期和平臺期。可用于區別不同處方的葉酸片，經驗證方法重復性較好。

評價溶出曲線相似性的方法眾多，各有優缺點，有些側重于對整體溶出度進行評價，有些則側重于對局部進行評價。本研究采用的f2法為整體比較法，其中f2計算簡便，能比較自制制劑與參比制劑溶出曲線的差異。具有區分力的葉酸片溶出曲線測定方法可用于區分不同處方工藝產品的質量差異，有利于進一步的處方篩選和工藝優化。本研究建立的體外溶出度測定方法可為評價葉酸片仿制制劑的內在質量及一致性評價研究提供試驗依據。在本品的一致性評價中，還應關注原料藥粒徑、晶型等因素的影響，為處方工藝優化提供全面技術支撐。