星點設計-效應面法優化載人參多成分納米脂質載體處方研究

尚爾雨，馬曉乾，孫 爽，申國濤

(1.黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科、人參屬多年生草本植物?！渡褶r本草經》將人參列為藥中上品。齊墩果酸、熊果酸、人參皂苷Rg3等是人參中的主要抗腫瘤成分，但由于這些成分的水溶性及生物利用度等性質的局限，使得人參的藥效受到局限[1-4]。近年來，對于難溶性成分的腫瘤靶向性的納米制劑的研究受到越來越多的關注[5-6]。

納米脂質載體(nanostructured lipid carriers，NLC)是一種將固體和液體的脂質在高溫條件下熔融，再經過低溫固化而形成的給藥體系[7]。NLC給藥體系中包載中藥中的難溶活性成分，用以提高靶向性及生物利用度等性能[8]，其優勢是納米載體將難溶性成分的溶解度提高。NLC還具有良好的生物相容性，可生物降解，控制藥物釋放，提高疏水藥物非口服給藥途徑的傳遞效率[9-11]。

星點設計-效應面法 (The central design-effect surface method，CCD-RSM)是一種多元非線性擬合，具有實驗次數少、預測值接近真實值、精度高等優點，是集數學與統計為一體的實驗方法，應用廣泛。本實驗擬通過CCD-RSM 來優化載人參多成分納米脂質載體的處方，可相對減少實驗次數，精度高，預測性好[12-13]。

1 儀器與材料

沃特斯2695高效液相色譜儀(美國Waters公司生產)，超聲波細胞破碎儀(美國Sonics公司生產)，電子分析天平(上海良平儀表有限公司生產)，Nano-ZS90激光粒度分析儀(馬爾文儀器有限公司生產)，透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭飛利浦公司生產)，恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司生產)，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(DIKMA公司生產)。

齊墩果酸(批號 130826)、熊果酸(批號 131107)、人參皂苷Rg3(批號 131029)均購于成都瑾哲生物有限公司。甲醇(色譜級)(DIKMA公司生產)，CTAB(天津市大茂化學試劑廠生產)。

2 方法

2.1 OUR-NLC的制備方法

精密稱定處方量的OA、UA和Rg3，選擇固定比例的固態脂質和液態脂質，水浴溶解于無水乙醇中，利用細胞超聲破碎儀，使油相分散在含有表面活性劑的水溶液中，采用減壓蒸發除去有機溶劑后，得到OUR-NLC。

2.2 制備工藝的優化及設計

采用單因素法對藥物用量比、油酸用量、表面活性劑濃度等因素進行考察， 結果發現，以上三個因素對制備OUR-NLC均有顯著影響，可進一步對制備工藝進行優化。采用CCD-RSM(三因素二水平)，將藥物用量比(X1，X2)、表面活性劑濃度(X3)、油酸的用量(X4)設為獨立因素，設中心點、析因設計點、極值點(即0，+1，-1)，得到真實值、代碼值見表1。以Y1(總包封率，%)，Y2(總載藥量，%)為響應參數安排試驗，見表2。

表1 實驗真實值和代碼值Tab.1 Experiment real and code value

表2 中心組合設計安排和結果Tab.2 Central combination design arrangement and results

2.3 優化工藝的處方驗證

依據最優條件制備OUR-NLC三批樣品，以總包封率及總載藥量實際值和估計值進行比較，計算其相對偏差。

2.4 穩定性考察

將三批次納米粒分別于4℃和25℃冰箱冷藏保存，分別在第1 d、3 d、7 d、15 d后對樣品的外觀、粒徑、包封率和載藥量進行觀察。

3 結果

3.1 模型擬合及方差分析

以Y1(總包封率，%)，Y2(總載藥量，%)分別對X1、X2、X3、X4進行模型擬合，得到回歸模型為：

(F:29.72;p-value:<0.000 1)

(F:48.38;p-value:<0.000 2)

由方程可知，擬合效果較好的為二項式方程。繪制三維效應面及二維等高圖，優化納米粒處方。結果見表3和表4。

表3 Y1響應面模型方差分析Tab.3 Variance analysis of Y1 response surface model

表4 Y2響應面模型方差分析Tab.4 Variance analysis of Y2 response surface model

續表4

結果表明，表3中，F值為8.84，說明模型顯著，導致產生噪音的幾率只有0.01%；P值<0.05模型顯著。模型顯著項為A2，B2，D2；P>0.1模型不顯著。

結果表明，表4中，F值為12.18說明模型顯著，P<0.05模型為顯著。從而得知模型的顯著項是AB、B2、D2，對于載藥量來說，投藥量、油酸用量是主要影響因素。

通過Oringin8.0統計軟件繪制三維效應面圖，見圖1和圖2。

圖1 Y1的三維圖和二維圖：自變量X1X2(A)，X1X4(B)和X2X4(C)Fig.1 3D and 2D of Y1: independent variable X1X2(A), X1X4(B) and X2X4(C)

圖2 Y2的三維圖和二維圖：自變量X1X2(A)，X1X4(B)和X2X4(C)Fig.2 3D and 2D of Y2: independent variable X1X2(A), X1X4(B) and X2X4(C)

結果顯示，圖1中， Y1(總包封率) 與X1(藥物用量)、X2(藥物用量)和X4(油酸用量)密切相關，當藥物和油酸用量增加時，總包封率表現為先升高后下降，總包封率為45.66%達到最高點。圖2中， Y2(總載藥量)與X1(藥物用量)、X2(藥物用量)和X4(油酸用量)密切相關。結果顯示各因素在中心點的水平值效果較優。

3.2 驗證優化處方

依據上述實驗指標的結果，最終確認X1=1.04、X2=1.03、X3=0.11%、X4=0.99 mL為最佳參數值。制備OUR-NLC三批樣品，計算其相對偏差，Y1(總包封率)和Y2(總載藥量)的實際值和估計值見表5，PS和ZP、PDI見表6和圖3。

圖3 粒徑和電位圖Fig.3 Particle size and potential diagram

表5 預測值和觀察值的比較 (n=3)Tab.5 Comparison of predicted and observed values (n=3)

表6 驗證結果 (n=3)Tab.6 Verification results (n=3)

由表可知，實測值與預測值各項指標的偏差均小于±5%，較小，說明經過處方優化后的二者相吻合，說明CCD-RSM預測效果較好，作為描述效應面與影響因素之間的密切關系是一種全面的分析方法。

由表6、圖3可知，選取最有處方制備三批樣品，觀測外觀均為乳白色液體。三批樣品之間的各項指標變化差異較小，表明方法重現性良好。

3.3 穩定性考察

結果表明，OUR-NLC在4℃條件下存放7 d，外觀均勻，無絮凝、沉淀，DL和Zeta電位稍下降，粒徑略增加，PDI與EE幾乎無變化。但是在25℃時，當粒徑逐漸增加，Zeta電位與載藥量、包封率呈現逐漸下降趨勢；在存放至3 d后，產生絮凝現象；存放15 d后，出現沉降狀態且為不可逆，此時包封率呈現明顯下降趨勢。由此得出，溫度是納米粒穩定性的較大影響因素[14-15]。

4 討論

NLC是一種在一定溫度下將固體脂質和空間上不相容的液體脂質混合制備從而得到的納米粒給藥載體，將與之化學性質差異很大的液態脂質加入到固態脂質中，使納米粒以結晶缺陷型或無定型的結構存在。在體溫條件下，NLC持續保持固體骨架結構，在引入適量的液體脂質后，其納米粒固體內部骨架性質并未改變，推測可能是由于加入液態脂質既能夠延緩固態脂質由α晶形轉化為β晶形，還有可能延緩藥物在儲存過程中的泄漏，增加其對藥物分子的包容性，提高藥物的包封率及載藥量，在儲存過程中避免藥物外排、包封率降低現象。

在納米結構脂質載體基質中，固、液脂質的性質與其差異程度是NLC載藥系統成型的關鍵。Jenning等人[16]用高壓乳勻機制備甘油三酯SLN和蠟類SLN，發現甘油酯SLN具有較好的包封率，蠟類SLN顯現的粒度分布和長期的物理穩定性則要優于甘油酯SLN。NLC作為一種新興的脂質納米微粒載體系統，具備生產成本較低、工藝單一、耐受性良好等優點，應用較為廣泛，包括注射、口服、經皮等給藥方式。

中藥是一個綜合復雜的化學組成系統，是在多種活性成分協同作用下產生療效的綜合體。但目前中藥納米劑型的研究大多集中于單一有效成分，由于單體化合物物理化學性質明確，所以其制備工藝也相對簡單，而多成分的共同存在會使納米載藥體系在包封過程中出現均衡包封較為困難的問題，因此選擇合適的處方顯得十分重要。

在OA、UA和Rg3三種藥物被包載于納米脂質載體中時，由于載體材料包載藥物的能力的有限性，三者之間可能存在一定競爭，其中藥物用量及三者比例對3個成分的包封率及載藥量均有一定程度的影響。通過對CTAB的濃度、投藥比、油酸比例、有機相與水相體積比等單因素的考察，選擇出適宜的指標和水平，為進一步進行處方篩選奠定了基礎。以三因素五水平的星點設計-效應面法展開實驗，優化的最佳制備處方為：水油體積比1.9∶1(mL/mL)，藥物用量14.5 mg，C乳化劑0.1%。按照優化的最佳制備處方制備OUR-NLC三批樣品，發現各項指標變化差異較小，顯示重現性良好。

人參多成分納米脂質載體的處方能夠有效包載OA、UA和Rg3三種成分，為包載化學結構和理化性質差異較大的中藥成分納米遞藥系統研究提供了方法和技術。