基于基因芯片對癲癇小鼠海馬組織miRNA-204表達的研究及生物信息學分析

吳 瓊， 呂婷婷， 刁麗梅

癲癇(Epilepsy)是由于大腦神經元異常放電引起短暫大腦功能失調的神經系統疾病，對患者學習和生活產生嚴重影響。全球每年有240萬人被診斷為癲癇，近30%的患者抗癲癇藥物無法控制癲癇發作，急需新的治療方法[1]。MicroRNA(miRNA)是一種長度為20～24個核苷酸的內源性非編碼蛋白的RNA，其通過與靶基因特定序列相互作用，調節靶基因表達的活性。miRNA異常的調節對癲癇的發生發展產生重要的影響，可能成為癲癇的潛在生物標記物和治療靶點。本研究利用基因芯片技術挖掘差異基因，并對差異基因進行生物信息學分析，探索miRNA對癲癇治療靶點作用機制，開拓癲癇診斷與治療新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 雄性昆明小鼠20只，清潔級，約25～30 g。昆明小鼠由廣西醫科大學動物實驗中心購買。

1.1.2 實驗試劑和儀器 鹽酸匹羅卡品(美國Sigma公司)、氯化鋰(中國醫藥集團上海試劑公司)、硫酸阿托品注射液(鄭州鈴銳制藥有限公司)、Aglient 2100 Bioanalyzer(美國Agilent公司)、Thremo Nanodrop 2000(美國 Thremo公司)、GeneChip Scanner 3000(美國Affymetrix公司)、GeneChip Fluidics Station 450(美國Affymetrix公司)、GeneChip Hybridization Oven 645(美國Affymetrix公司)。

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 將制昆明小鼠按隨機數字表法隨機分為造模組和對照組。造模組：昆明小鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～24 h后注射阿托品 (1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)，每2 d進行造模實驗1次，共5次，Ⅳ級以上發作為造模成功。對照組：同樣方法注射生理鹽水。

1.2.2 實驗過程 分別取造模組和對照組小鼠腦部海馬組織，進行基因芯片檢測，選出模型組和對照組表達差異的基因。采用miRNA靶基因預測工具TargetScan、rna22、miRBase進行預測并取交集。利用DAVID數據庫，將取交集后靶基因基因按功能分為3大類：生物學過程、細胞組分和分子功能3類，后進行KEGG通路分析。

1.2.3 統計學分析數據 使用SPSS 21.0進行處理，組間比較使用t檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 差異基因 根據實驗結果，篩選|FC|≥ 1.5的miRNA進行預測分析：相對表達增多的差異miRNA 10個，相對表達減少差異miRNA 18個，結合實驗結果及相關文獻，選取 miRNA-204進行預測分析。

2.2 靶基因預測 采用TargetScan共預測到miRNA-204靶基因6762個，rna22共預測到miRNA-204靶基因14335個，miRBase共預測到miRNA-204靶基因587個，取三者交集得到457個共同的靶基因。

2.3 靶基因GO分析 通過DAVID分析工具對miRNA-204靶基因進行分析發現，miRNA-204靶基因靶基因富集于21個基因功能(P<0.01)。miRNA-204靶基因富集在生物學過程：大腦發育、磷脂酰肌醇代謝過程、離子運輸、蛋白質運輸、蛋白質硫酸化、類固醇激素介導的信號傳導、線粒體去極化、細胞對缺氧的反應、GTP酶介導的信號轉導、肌動蛋白細胞骨架組織等相關生物學過程。miRNA-204靶基因主要作用在：突觸后膜、高爾基體膜、細胞核、細胞質內等細胞組分。miRNA-204靶基因富集的分子功能包括：與蛋白質結合和金屬離子結合、調控類固醇激素受體活性及GTPase活化劑活性(見圖1)。

圖1 miRNA-204靶基因富集分析

2.4 miRNA-204靶基因KEGG分析 miRNA-204靶基因主要富集在16條通路中(P<0.05)：Wnt信號傳導通路、磷脂酰肌醇信號系統、神經活性配體-受體相互作用通路、鞘脂信號轉導通路、鈣信號通路、Hippo信號通路、cGMP-PKG信號傳導通路、癌細胞膽堿代謝、血管平滑肌收縮、晝夜節律、胰腺分泌、唾液分泌等相關通路(見圖2)。

圖2 miRNA-204靶基因KEGG分析

3 討 論

本實驗研究利用基因芯片發現miRNA-204在氯化鋰-匹羅卡品癲癇小鼠海馬組織表達減少。已有研究報道與本實驗基因芯片檢測結果相一致：Raoof R等[2]研究發現，miRNA-204在顳葉癲癇及癲癇持續狀態患者的腦脊液中表達顯著減少，Xiang等[3]研究也顯示在體外培養的癲癇持續狀態海馬神經細胞中miRNA-204顯著下調，miRNA-204 通過調節 TrkB 和下游ERK1/2-CREB信號通路在海馬神經元模型中發揮抗癲癇作用。在Xia等[4]在膠質細胞瘤繼發的癲癇腦組織中發現，miRNA-204表達水平明顯低于正常腦組織的表達量，并且發現miRNA-204可以顯著抑制了膠質瘤細胞的生長、遷移和侵襲。

本實驗研究中預測的miRNA-204靶基因的功能GO富集顯示：miRNA-204與大腦發育關系密切，相關研究也證實miRNA-204在神經發育過程中起關鍵作用，包括在軸突誘導控制中的作用和在神經系統發育中的重要作用[5]。miRNA-204在驚厥性腦損傷后表達顯著增加，可減少驚厥誘導的神經細胞凋亡，加速神經細胞軸突的生長與延伸[6]。然而，一些研究也提示miRNA-204可導致大腦海馬神經元突觸可塑性下降，影響海馬組織調控的認知功能改變。隨著年齡增長，海馬中miRNA-204表達上調，而EphB2和NR1表達降低，miRNA-204可通過調控EphB2和NR1影響海馬突觸可塑性下降，可能導致年齡相關認知功能的改變[7]。在KEGG通路分析顯示miRNA-204靶基因富集于Wnt信號通路的有：AF366264、VANGL1、BTRC、PRKCG、FZD3、DAAM1、DAAM2、WNT2、MAP3K7、RAC2、SFRP1、PRICKLE2、PLCB1、FBXW11。

經典Wnt/β-catenin通路調節海馬神經發生、突觸分裂和線粒體調節，對中樞神經系統的發育和功能至關重要[8]。相關的研究發現，β-catenin在對低氧發作反應中出現巨大的轉錄變化，β-catenin在神經元結構的形成和維持以及促進突觸可塑性方面具有重要作用[9]。另一項研究通過使用Wnt通路抑制劑，減少了紅藻氨酸誘導小鼠癲癇發作次數，顯示了Wnt通路治療癲癇潛在有效性[10]。Wnt信號通路參與癲癇急性期和慢性期，誘發的神經發生和神經元死亡[11]，急性期癲癇發作時Wnt信號通路激活，導致了短暫的神經代謝的改變，隨著癲癇發作的持續，Wnt信號通路將激活mTOR通路，導致癲癇慢性發作。癲癇發生的早期有一個治療窗口，Wnt信號通路啟動了短暫的代謝，這一系列的代謝重組變化可能影響神經異常發生和分化，從而影響癲癇敏感性[12]。同時值得注意的是，長鏈非編碼RNA Uca1可以通過降低miRNA-375的水平來促進Sfrp1的表達，進而通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，抑制癲癇小鼠神經元細胞的異常增殖，預防癲癇發作[13]。長鏈非編碼RNA Peg13可通過miRNA-490-3p/Psmd11軸抑制Wnt/β-catenin通路，減緩小鼠癲癇進展[14]。

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，在臨床中有許多患者對目前所有可用的治療藥物都有一定的耐藥性。現有的抗癲癇藥物治療主要是減少興奮和預防癲癇發作，但不能影響疾病的潛在病理生理。最近，有許多研究工作集中在確定抗癲癇治療的機制靶點，以防止慢性癲癇的進展。在本實驗中預測miRNA-204的靶基因富集功能和KEGG通路部分已經被證實，其中Wnt/β-catenin信號通路可能是未來抗癲癇治療的十分有前景的癲癇治療靶點。本課題組將在以后的研究中對miRNA-204靶基因和Wnt/β-catenin信號通路完善相關實驗研究，進一步驗證其對癲癇發生發展的影響。