急性腦梗死患者血清MMP-9、miR-221表達水平檢測及臨床價值探索

馮佳佳， 劉 丹， 張廣煒， 金麗霞

急性腦梗死(acute cerebral infarct，ACI)是神經內科及急診科最常見的急危重癥之一。據統計，在我國ACI約占腦卒中總發病率的80%[1]，其致殘率、致死率、復發率極高。但ACI的早期診斷仍局限于影像學，具有診斷意義的循環標志物尚未發現。近年來諸多研究證實，約20%的miRNAs在ACI患者的外周血中表達異常且與其病理相關[2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一組蛋白水解性鋅依賴內肽酶，參與中樞神經系統疾病的病理生理過程[3]。其中MMP-9在ACI的研究已經有一定的歷史背景，但miR-221在腦血管疾病領域的研究尚少。因此本研究旨在探討ACI患者血清MMP-9、miR-221表達水平，并分析二者聯合檢測對ACI的診斷價值，若能達到預期結果，二者聯合檢測有望成為ACI的診斷性循環標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年12月-2021年12月在我科收治的ACI患者50例為病例組，同期健康體檢者50例為對照組。納入標準：(1)符合1996年全國第四屆腦血管病學術會議修訂的腦梗死診斷標準，且經頭部CT或MRI檢查證實；(2)滿足CISS分型標準，CISS分型為動脈粥樣硬化性腦梗死；(3)年齡≥18歲，發病時間≤7 d。排除標準：(1)既往有腦出血病史或CT顯示腦出血；(2)有明顯的心、肝、腎功能不全及惡性腫瘤；(3)存在心房顫動等嚴重心律失常；(4)心源性栓塞所致的腦卒中患者。本實驗通過科研倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 ELISA檢測血清MMP-9的含量 用干燥管收集患者入院次日清晨空腹肘靜脈血4 ml，常溫下3000 rpm離心5 min，用高壓滅菌的EP管收集分離后的上層血清，-80 ℃保存，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測MMP-9的含量，操作流程嚴格按照ELISA試劑盒說明書(武漢新啟迪生物科技有限公司)進行。

1.2.2 qRT-PCR檢測血清miR-221的表達水平 用EDTA管收集患者入院次日清晨空腹肘靜脈血2 ml，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-221的表達水平。按照Trizol試劑說明書(Invitrogen life technologies公司)抽提血清總RNA。cDNA合成：取總RNA樣品800 ng(8 μl)，加入緩沖液，Mix共20 μl，RT反應條件為：16 ℃，30 min；42 ℃，40 min；85 ℃，5 min，-20 ℃保存。實時定量PCR：U6作為內參，在cDNA樣品中加入SYBR Green進行PCR擴增，PCR循環參數：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s共40個循環，用2-△△Ct計算miR-221的相對表達量。

2 結 果

2.1 病例組和對照組臨床資料比較 兩組患者在年齡、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而性別、高血壓、糖尿病和高脂血癥比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 病例組與對照組臨床資料比較

2.2 病例組與對照組血清MMP-9和miR-221表達水平比較 病例組患者血清MMP-9的表達水平(1.77±0.55)(μg/L)顯著高于對照組(1.01±0.22)(μg/L)，差異有統計學意義(P<0.001，見圖1A)；病例組患者血清miR-221的表達水平(2.29±2.51)顯著高于對照組(1.13±1.09)，差異有統計學意義(P<0.01，見圖1B)。

注：病例組與對照組比較**P<0.01,***P<0.001圖1 A：對照組與病例組血清MMP-9的比較；B：對照組與病例組血清miR-221的比較

2.3 病例組與對照組臨床資料及血清MMP-9、miR-221的相關性分析 ACI與性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、MMP-9、miR-221呈正相關(P<0.05，見表2)；ACI患者的MMP-9與miR-221不相關(r=0.193，P=0.055)。

表2 病例組與對照組臨床檢驗和實驗指標的相關性分析

2.4 急性腦梗死發病危險因素的Logistic回歸分析 以急性腦梗死為因變量，性別、高血壓、高脂血癥、MMP-9、miR-221為自變量，進行二元Logistic回歸分析，在校正其他危險因素后，結果顯示性別、高脂血癥、MMP-9、miR-221有統計學意義(P<0.05)，是ACI發病的獨立危險因素(見表3)。

表3 急性腦梗死發病危險因素的Logistic回歸分析

2.5 血清MMP-9、miR-221診斷急性腦梗死的ROC曲線 以預測概率做ROC曲線(見表4、圖2)，結果顯示：MMP-9、miR-221的AUC分別為0.899、0.746，聯合檢測的AUC為0.924，此時的敏感度為82%，特異性為98%。經過ROC分析曲線下成對樣本區域差異計算得出，預測概率與MMP-9之間AUC差異具有統計學意義(P=0.041<0.05)。由此得出，MMP-9、miR-221聯合檢測較單項檢測更有助于ACI的診斷。

圖2 血清MMP-9、miR-221、聯合檢測診斷急性腦梗死的ROC曲線

表4 ROC曲線分析

3 討 論

動脈粥樣硬化是ACI最重要的病理因素，頸動脈粥樣硬化不穩定斑塊已被列為ACI的極高危險因素[4]。MMP-9通過降解膠原纖維及細胞外基質，使得纖維帽薄弱、頸動脈斑塊不穩定，從而形成血栓誘發腦梗死[5]。前期研究已經證實MMP-9在腦梗死發病2 h內會升高[6]，超急性期腦梗死患者血清MMP-9水平與病情嚴重程度和梗死體積顯著相關[5]。

本實驗結果顯示，與對照組相比，病例組患者血清MMP-9水平顯著增高，且與ACI呈正相關，Logistic回歸分析顯示MMP-9是ACI發病的獨立危險因素。ROC曲線分析顯示，當MMP-9≥1.384(μg/L)時所對應的敏感度是84%，特異性為94%，AUC為0.899，對ACI的診斷價值較高。Choi[7]等人通過大腦中動脈短暫閉塞動物模型發現，MMP-9是ACI潛在生物學標志，可作為輔助功能評估腦梗死。本實驗結果與前期研究結果相符，更加佐證了MMP-9有望成為診斷腦梗死的循環標志物之一。

MiRNAs是一種小的非編碼RNA，通過識別同源序列和干擾轉錄、翻譯或表觀遺傳過程來調節基因的表達，參與了許多復雜生物網絡通路的調節[8]。近年來越來越多的證據表明，循環miRNAs能夠調節ACI病理過程的靶點，被認為是ACI潛在的診斷性循環標志物[9]。例如：Zhou[10]等人報道miR-21和miR-24的血漿水平可能作為ACI的關鍵分子介質；Wu[11]等人認為ACI患者血漿中miR-99b表達下調，有可能成為診斷ACI的潛在指標。

本實驗主要探討的是病例組血清miR-221的表達水平與對照組之間的差異，結果顯示病例組血清miR-221水平顯著高于對照組，Logistic回歸分析顯示：miR-221是ACI發病的獨立危險因素。ROC曲線顯示：當miR-221≥1.146時所對應的敏感度是78%，特異性為70%，AUC為0.746，對ACI的診斷價值具有中度準確性，MMP-9與miR-221聯合評估時AUC為0.924，對ACI具有較高的診斷效能。Sofie[12]等人研究發現ACI患者外周血中miR-221-3p與健康對照組相比表達上調。Tsai[13]等人研究發現，miR-221在健康人群中的平均表達水平最低，其次是動脈粥樣硬化組，腦卒中患者組中表達最高。Sandra[14]等人研究顯示miR-221在進展性頸動脈粥樣硬化患者中表達顯著增高。我們的實驗結果與前期研究結論相符。無獨有偶，研究發現在急性心肌梗死患者血清中miR-221的表達水平顯著高于健康對照組[15]；在急性肺栓塞患者血清中miR-221水平也顯著高于健康人群[16]。我們的實驗結果顯示性別、高脂血癥也是ACI發生的危險因素，與大量的回顧性研究結果相吻合[17]。

本研究的不足之處首先在于研究對象的數量和地域有一定的局限性；其次，本次研究ACI患者的血液樣本是在臨床事件發生后采集的，所以因果關系只能推斷；再次，在本實驗所收集的樣本中，對照組和病例組之間是否患有糖尿病是存在顯著差異的，而既往研究表明高血糖可誘導miR-221表達上調[15]；最后，藥物治療是否會影響ACI患者血清MMP-9、miR-221表達水平我們尚不清楚。這些都可能是導致此次實驗結果的原因。未來期望繼續擴大樣本及嚴守質控來驗證實驗結果。

綜上所述，MMP-9和miR-221的表達與ACI的發生密切相關，且二者聯合檢測有助于ACI的早期診斷，有更高的敏感性和特異性，有望成為ACI早期診斷理想的組合靶標，值得在臨床上進一步的研究和推廣。