過熱蒸汽滅菌松花粉的安全性毒理學(xué)評價(jià)研究

張惠惠，崔議方，宋書祎，蘭先明，張中磊，李悅，張穩(wěn)穩(wěn)*，張加余*

(1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 煙臺(tái) 264003； 2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

松花粉為松科植物馬尾松、油松或同屬植物的干燥花粉，營養(yǎng)成分豐富，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就已被記載，被認(rèn)為“甘、溫、無毒”，有“潤心肺、益氣、祛風(fēng)止血、壯顏益志”的功效，是祖國醫(yī)藥學(xué)寶庫中僅有的食藥兼用花粉品種[1]，但是源自自然界的松花粉不可避免的會(huì)攜帶各種微生物，因此，對松花粉進(jìn)行滅菌十分必要。目前，食品滅菌的方法有多種，應(yīng)用最廣的是輻照滅菌，其可在保證滅菌效果的基礎(chǔ)上，能較好地保存花粉的營養(yǎng)成分[2]。一般來說，一定劑量內(nèi)輻照滅菌食品是安全的，但仍有部分消費(fèi)者不認(rèn)可輻照食品。同時(shí)，隨著消費(fèi)者對食品安全衛(wèi)生性能要求的提高，食品制造企業(yè)對微生物管理的要求也越來越嚴(yán)格[3]。

過熱蒸汽是對飽和蒸汽繼續(xù)加熱，在相同壓力下溫度高于沸點(diǎn)的水蒸氣，采用過熱蒸汽滅菌能夠使物料受熱更均勻，傳熱更快，有效滅殺食品中的微生物及芽孢[4]。本文通過對過熱蒸汽滅菌松花粉進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)及大鼠28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)等毒理學(xué)評價(jià)試驗(yàn)研究，旨在為過熱蒸汽滅菌松花粉及其產(chǎn)品開發(fā)提供毒理學(xué)安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 受試物 過熱蒸汽滅菌松花粉(煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，過熱蒸汽滅菌工藝：145～165 ℃，壓力0.2～0.3 Mpa，4～6 s)，產(chǎn)品批號為1640512-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠和ICR小鼠均由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。

1.3 菌株及S9 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)選用經(jīng)鑒定符合要求的菌株，均購自美國Moltox公司，其中S9批號：2895；TA1535批號：4694D；TA100批號：4678D；TA102批號：4677D；TA97a批號：4689D；TA98批號：4689D。

1.4 試劑試藥與主要儀器 環(huán)磷酰胺(Sigma-Aldrich公司，批號：WXBC2421V)；AMES陽性對照藥物：4-硝基喹啉氮氧化物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：N113910)；疊氮鈉(Amresco公司，批號：0639)；絲裂霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：131101)； 2-氨基芴(上海晶純試劑有限公司，批號：13152)。

SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(tái)；MCO-20AIC恒溫培養(yǎng)箱；DHG-9203A電熱恒溫干燥箱；DK-8D電子恒溫水浴鍋；HV-50高壓滅菌器；Milli-Q IQ7000純水儀；NanoDrop One C超微量分光光度計(jì)；Supcre G9全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)分析儀；Sysmex XN-1000全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀；Roche cobas c 311全自動(dòng)生化分析儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參照GB15193.3-2014，按照限量法設(shè)10 g·(kg·BW)-1劑量組。取SPF級ICR小鼠16只，體重18～22 g，雌雄各半，按照10 mL·(kg·BW)-1的灌胃容量灌胃0.5 g·mL-1的供試品混懸液2次，間隔4 h，連續(xù)觀察14 d，觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.2 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) 參照GB15193.4-2014，采用平板摻入法，使用鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌TA1535、TA100、TA102、TA97a、TA98五個(gè)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿5個(gè)受試物劑量，另設(shè)空白對照組與陽性對照組，每個(gè)劑量做3個(gè)平行皿，整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做2次并分別統(tǒng)計(jì)。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) 參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)，設(shè)置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13個(gè)口服劑量組和環(huán)磷酰胺陽性對照組40 mg·(kg·BW)-1及陰性對照組，每組動(dòng)物10只，通過口腔灌胃每24 h給藥1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥后30 d 處死小鼠，取附睪制片，伊紅染色，每只小鼠為一觀察單位，計(jì)數(shù)1 000條完整的精子中畸形精子數(shù)，計(jì)算各組小鼠精子畸變率。

2.4 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 參照GB15193.5-2014，設(shè)置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13個(gè)口服劑量組，另設(shè)溶媒對照組、陽性對照組(腹腔注射給予40 mg·kg-1的環(huán)磷酰胺)，每組動(dòng)物10只，通過口腔灌胃每24 h給藥1次，連續(xù)給藥2次，末次給藥后約18～24 h內(nèi)，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色，在光學(xué)顯微鏡下，每只小鼠計(jì)數(shù)2 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，并記錄微核發(fā)生率(‰)，同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)骨髓紅細(xì)胞[嗜多染紅細(xì)胞(PCE)加正染紅細(xì)胞(NCE)]，求出嗜多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞的比值，即PCE/(PCE+NCE)的比值。如出現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即確認(rèn)為陽性結(jié)果。

2.5 28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn) 設(shè)5、2.5、1.25 g·(kg·BW)-13個(gè)劑量組和1個(gè)溶媒對照組，每組動(dòng)物16只，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，連續(xù)灌胃28 d后試驗(yàn)結(jié)束。處死大鼠，觀察血常規(guī)、血清生化學(xué)指標(biāo)和病理檢查。病理組織學(xué)檢查時(shí)先對高劑量組和對照組動(dòng)物的主要臟器進(jìn)行，如果發(fā)現(xiàn)病變后需對較低劑量組相應(yīng)的器官及組織制片檢查。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，各組動(dòng)物的微核率及 PCE/(PCE+NCE)比值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述；精子畸形實(shí)驗(yàn)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)是精子畸形發(fā)生率至少為陰性對照組的兩倍或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系者，或者至少應(yīng)該有兩個(gè)相鄰劑量組的精子畸形率達(dá)到陰性對照組的兩倍或經(jīng)檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠28 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述。組間比較采用組間比較t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 以10 g·(kg·BW)-1劑量連續(xù)灌胃后觀察14 d，小鼠存活率100%，且無明顯異常狀態(tài)。依據(jù)急性毒性分集評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定，該受試物對小鼠LD50>5 g·(kg·BW)-1，屬于實(shí)際無毒級。

3.2 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) 在本試驗(yàn)條件下，各菌株自發(fā)回變菌落數(shù)(溶劑對照)在實(shí)驗(yàn)室正常范圍內(nèi)，陽性對照回變菌落數(shù)均明顯高于溶劑對照(回變菌落數(shù)是溶劑對照2倍以上，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，提示試驗(yàn)體系可靠。抑菌試驗(yàn)表明，松花粉樣品濃度達(dá)5 000 μg/皿時(shí)，對所有菌株(TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535)均無抑菌作用。試驗(yàn)用此濃度作為最高濃度，結(jié)果表明細(xì)菌生長背景良好。不同濃度松花粉樣品(5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿)，對所有測試的菌株無論在無S9代謝活化系統(tǒng)的直接作用還是經(jīng)S9代謝活化系統(tǒng)作用后均未引起回變菌落數(shù)的增加(見表1～2)。

表1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

表2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

3.3 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 受試物各劑量組與陰性對照組的微核發(fā)生率在0.6‰～1.3‰之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核發(fā)生率為雌性小鼠34.20‰，雄性小鼠27.20‰。各劑量組骨髓細(xì)胞微核率與陰性對照組相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示未見該受試物哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率在3.98%～4.10%之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組為8.71%，各劑量組動(dòng)物精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產(chǎn)生致突變作用。

3.5 28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間各組動(dòng)物未見明顯中毒表現(xiàn)，大鼠生長發(fā)育良好，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，無動(dòng)物死亡。各劑量組動(dòng)物體重、體重增加與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、臟器絕對重量及臟/體比值與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；病理組織學(xué)檢查，各劑量組大鼠的臟器未發(fā)現(xiàn)異常，臟器系數(shù)與對照組比較未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示該受試物對大鼠的臟器組織無損害作用(見表3～5)。

表3 松花粉對動(dòng)物體重的影響

表4 松花粉對血液學(xué)指標(biāo)的影響

表5 松花粉對血生化指標(biāo)的影響

4 討論

松花粉是一味歷史悠久的藥食同用類中藥，曾有記載稱松花粉在春季采集，稟天春和之木氣，得地中正之土味，歸足厥陰肝、足太陰脾二經(jīng)，有益肝之陽氣及脾之陰氣，具有散肝除風(fēng)、和脾止血的功效[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明，松花粉具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖與傷口愈合、調(diào)節(jié)免疫、抗化學(xué)性肝損傷等功效。為了除去松花粉中攜帶的微生物，本實(shí)驗(yàn)以食品滅菌中常用的加工手段過熱蒸汽滅菌法為滅菌方法進(jìn)行處理。其基本原理依據(jù)是常用的加熱殺菌法食品工藝技術(shù)，在加壓的情況下，對飽和蒸汽再進(jìn)行加熱以后形成的水蒸氣，在一定的設(shè)備設(shè)施中與待滅菌物料接觸，從而達(dá)到物料滅菌的效果，并避免物料結(jié)塊、風(fēng)味損失等一系列問題。過熱蒸汽滅菌法可用于香味料、蕎麥粉、可可豆和谷類等的滅菌處理。大量實(shí)驗(yàn)表明，過熱蒸汽不僅殺菌效果好，而且熱敏性物質(zhì)的保存率較高。例如，高速攪拌式過熱蒸汽殺菌法用于小麥粉等的殺菌[22]，能有效降低小麥粉中微生物含量，并且能較好維持小麥粉結(jié)構(gòu)特性，顆粒形態(tài)完整，雙折射強(qiáng)度幾乎沒有變化；塔式過熱蒸汽殺菌法也常被用于處理冷凍干燥蔬菜制品，能最大限度地保存色、香、味及其營養(yǎng)成分[23]。

食品安全關(guān)系民生，食品安全性毒理學(xué)評價(jià)是食品安全食用與開發(fā)的前提。松花粉作為重要的食用藥用資源及中藥保健食品的開發(fā)原料，對其產(chǎn)品的安全性毒理學(xué)評價(jià)顯得尤為重要。本研究表明，過熱蒸汽滅菌松花粉最大給藥劑量達(dá)10 g·(kg·BW)-1下，未見動(dòng)物有中毒癥狀和死亡，急性經(jīng)口毒性屬于實(shí)際無毒級。細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形3項(xiàng)遺傳毒性組合試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明過熱蒸汽滅菌松花粉無致突變作用。28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn) 結(jié)果表明，動(dòng)物生長發(fā)育正常，體重持續(xù)增長正常，行為無異常，無中毒及死亡癥狀，血常規(guī)和血液生化等指標(biāo)等均未受明顯影響，且經(jīng)組織病理學(xué)檢查均未見與受試物作用有關(guān)的病理學(xué)改變，提示該過熱蒸汽滅菌松花粉未見毒性作用。

綜上所述，上述試驗(yàn)結(jié)果均表明過熱蒸汽滅菌松花粉并無明顯毒性作用，安全性較高。本研究可為松花粉滅菌工藝優(yōu)選以及松花粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定依據(jù)。