宏基因二代測序技術輔助診斷恙蟲病腦膜炎1例報告

陳兆宇， 曾 瓊， 魏麗玲， 官遠林

恙蟲病又稱叢林斑疹傷寒，是一種自然疫源性的急性發熱性疾病，由恙蟲立克次體感染引起。其主要癥狀為發熱、叮咬處焦痂、局部淋巴結腫大及皮疹。該病可累及全身各系統，包括肺、肝、心臟[1]等。當其累及中樞神經系統(central nervous system，CNS)時，除了以上臨床癥狀外，還會出現頭痛、嘔吐、頸項強直甚至意識障礙等表現，與病毒性腦膜炎等CNS感染性疾病難以鑒別。宏基因二代測序(metagenomic next generation sequencing，mNGS)是一種高通量測序技術，可快速、準確而全面地檢測標本中各種微生物，在感染性疾病的診斷方面擁有著巨大的潛力[2]。目前有關mNGS在恙蟲病腦膜炎診斷價值方面的報道仍較少。本文報告1例因發熱、頭痛入院的患者，未見典型焦痂等表現，腦脊液病原學檢查及頭部MR亦無明顯異常，經抗病毒、抗感染等治療均無效，最終使用mNGS技術檢測到腦脊液中恙蟲東方體確診，及時換用多西環素治療后病情得到緩解。

1 臨床資料

患者，男性，50歲，采茶場農民。因“頭痛4 d，發熱1 d” 于2020年11月8日收入汕大附一醫院。患者11月4日無明顯誘因開始出現全頭部持續性脹痛，伴惡心，無嘔吐，間斷干咳，無乏力、咽痛，無頭暈，無畏寒發熱等，遂到當地醫院就診，完善頭部CT提示左側基底節區腔隙性腦梗死(未見報告)。期間頭痛癥狀逐漸加重，11月7日早晨開始出現發熱，體溫最高39.3 ℃，予抗感染、止痛等治療后無明顯好轉。遂為進一步治療于11月8日擬“頭痛、發熱查因：顱內感染？”轉到我院。既往史及家族史無特殊。個人史：無外地久居史，工作原因每日均需到山林茶場中，否認煙酒史。入院查體：體溫37.4 ℃，血壓 138/64 mmHg，心率80次/min，呼吸20次/min。神志清楚，精神疲，心肺腹查體未見明顯異常。神經系統查體：記憶力、理解力、定向力正常，言語清晰，對答切題，雙側額紋對稱，雙側瞳孔等圓等大，直徑約2.5 mm，對光反射靈敏，雙眼球各向運動無受限，無眼震，雙側鼻唇溝對稱，伸舌居中。頸軟無抵抗，頦胸距2橫指，雙側克氏征(-)，四肢肢體肌力V級，肌張力正常。雙側病理征(-)。感覺系統、共濟運動檢查無異常。輔助檢查：血常規提示白細胞10.02×109/L、嗜中性粒細胞比例66.37%，生化提示羥丁酸脫氫338.21 U/L、乳酸脫氫酶597 U/L、谷草轉氨酶112.27 U/L，谷丙轉氨酶79.17 U/L、谷氨酰轉肽酶266.26 U/L、總膽紅素28.85 μmol/L、直接膽紅素12.12 μmol/L、間接膽紅素16.73 μmol/L，血沉21 mm/h，C反應蛋白71.10 mg/L，降鈣素原1.47 ng/ml。病原學檢查：HIV抗體、乙肝表面抗原、梅毒螺旋體抗體、肺炎支原體IgM抗體、外斐試驗、肥達試驗均陰性，結核桿菌抗體測定弱陽性，血培養未見異常。胸部CT：雙肺散在絮片、條片密度增高模糊影，雙肺下葉為主。結論：雙肺炎癥。頭部MR平掃+MRA+MRV：雙側額葉白質區散在小點狀缺血灶(見圖1)。

MRA示輕度腦動脈硬化，MRV未見異常。腦電圖：兩側以枕區大致對稱10～11c/s，10～30 uV α波為主節律，波形及調節欠佳，間斷有略多低電壓β活動；各導聯可見較多彌散性最高波幅達38uV θ波、θ活動。O-C：α波大部分抑制。Hv及閃光刺激：仍見較多彌散性最高波幅達47 uV θ波、θ活動及數個δ波；結論：輕-中度不正常腦電圖。初步診斷為：顱內感染；肺炎；肝功能不全。入院后予哌拉西林舒巴坦鈉(3 g/次，每8 h 1次)抗感染治療，以及退熱、護肝、維持內環境穩定等對癥支持治療。住院期間患者仍反復發熱，每日熱峰間于39.0 ℃～39.6 ℃，頭痛程度漸進性加重，仍有惡心，無嘔吐，同時開始出現上腹部脹痛不適，伴納差，零星咳嗽、痰少。11月10日早晨開始出現胸背部散在大小不等淡紅色風團樣皮疹，伴輕度瘙癢。查體示出現輕度頸抵抗，頦胸距3橫指，右側克氏征(+)，左側克氏征可疑(+)，予加用脫水降顱壓治療(甘露醇20% 125 ml/次，1 d 2次)。為進一步明確病因，分別于11月10日、11月13日行腰椎穿刺術，取腦脊液行常規、生化、免疫生化、細菌及真菌培養等檢查結果(見表1)。

另留取標本2 ml外送行腦脊液mNGS。兩次腰穿測得顱內壓明顯升高，腦脊液均呈無色透明狀，常規、生化結果提示有核細胞數、蛋白輕度升高，糖和氯化物含量正常，與病毒感染相關腦脊液改變類似。綜合患者急性起病過程，發熱、頭痛和頸項強直等表現，以及頭部MR平掃結果，考慮為病毒性腦膜炎可能。遂于11月13日加用更昔洛韋(0.3g/次，每12 h 1次)抗病毒治療。期間查房時發現患者右胸上外側近肩關節處有一大小約7 mm×7 mm暗褐色皮損，其上曾有結痂痕跡，痂皮基本已脫落(見圖2)。

結合患者長期頻繁野外作業史及癥狀特點，考慮此皮損可能為焦痂脫落后的痕跡，疑診恙蟲病。11月15日腦脊液mNGS回報示：恙蟲病東方體，特異性序列數76，基因組覆蓋度39565bp/0.2549%，其基因組核苷酸分布序列等結果(見圖3)。

最終明確診斷為：恙蟲病腦膜炎，合并恙蟲病相關肝功能損害及肺炎。立即停用更昔洛韋，改用多西環素(100 mg/次，每日2次)口服，其余繼續護肝、維持內環境穩定等對癥支持治療。11月16日后患者未再發熱，胸背部皮疹逐漸消退，無遺留色素沉著、瘢痕等。此后頭痛癥狀逐漸好轉，上腹部不適及咳嗽、咳痰等癥狀均有不同程度改善。11月20日再次行腰椎穿刺術檢查，測得顱內壓恢復正常，但腦脊液檢查結果仍提示有核細胞數及蛋白輕度升高(見表1)。11月24日復查頭部MR未見異常，此時患者頭痛及上腹部不適癥狀已基本緩解，仍有零星咳嗽，精神狀態明顯改善，查體示腦膜刺激征轉陰。患者及家屬拒絕繼續住院治療要求出院，予簽字辦理自動出院，出院后未再復診。

表1 患者腦脊液檢查結果

2 討 論

恙蟲病是一種自然疫源性的急性發熱性疾病，病原體為恙蟲病立克次體，以鼠類等嚙齒動物為中間貯存宿主，通過恙螨幼蟲進行傳播。起病急，臨床表現有高熱、頭痛、全身酸痛乏力、皮疹、淋巴結腫大及皮膚焦痂等。癥狀多不典型，僅有約一半原發感染者和小部分繼發感染者會在恙螨叮咬處形成無痛性焦痂，常于身體隱匿處(如：腋窩、會陰)較難被發現[1]。恙蟲病病理表現為小血管炎及血管周圍炎，可累及全身各系統，表現為肝功能損害[3]、肺部感染[4]、急性呼吸窘迫綜合征及CNS損害等。當CNS受累時常發生腦膜炎或腦膜腦炎，少見的有外展神經麻痹、急性橫貫性脊髓炎等[5]，常見癥狀有頭痛、嘔吐及意識障礙，體征表現為腦膜刺激征陽性。發病機制現尚未明確，Bohacsova的研究表明立克次體可引起神經元形態學退化和細胞內ATP的減少[6]，而另一項動物試驗則提示立克次體可能是通過引起CNS炎癥反應致病的[7]。恙蟲病CNS感染尚無公認診斷標準，當滿足恙蟲病診斷條件，出現CNS受累癥狀、體征，腦脊液正常或呈與病毒感染類似的改變，頭部影像學檢查伴或不伴異常[8]時，再除外其他原因所致的CNS損害后，可考慮診斷。診斷恙蟲病除了依靠流行病學史、臨床表現外，實驗室檢查也是重要的一部分，其中包括血清學和分子生物學兩類。血清學檢查有外斐試驗、間接免疫熒光分析法(indirect immunofluorescent assay，IFA)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等[9]。臨床上應用較多的是外斐試驗，價格便宜、操作簡單，但常因患者機體未能產生有效免疫應答、免疫功能低下等因素出現假陰性，起病1 w內陽性率低[10]。我院并未開展變形桿菌屬XK菌株的O抗原凝集試驗，因此本例外斐試驗陰性。IFA被認為是診斷恙蟲病的金標準[11]，但費用昂貴、操作復雜、周期較長、檢驗結果缺乏客觀性等[12]因素使其并未廣泛開展。

分子生物學檢測方法包括PCR法、環介導等溫擴增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)法、及宏基因組二代測序(metagenomic next generation sequencing，mNGS)等[12]，本文病例即選用mNGS協助診斷。mNGS全稱為宏基因二代測序技術，該方法通過提取腦脊液、血液等標本所有微生物的總DNA，基于Illumina、BGI、Oxford Nanopore、PacBio等平臺進行文庫構建，上機檢測標本所有核酸序列后在基因組參考數據庫中進行微生物比對、鑒定，最終確定責任微生物。與傳統病原學檢查方法對比，優點在于：(1)無針對性，直接檢測標本中所有微生物核酸序列，并能根據特異性序列數對微生物進行定量或半定量化，對各種已知、未知病原體的檢測都具參考意義;(2)不易受抗生素治療、微生物生長條件、患者免疫功能等因素影響;(3)需時短，最快可于48 h內完成[13];(4)可提供菌株比對鑒定、耐藥性預測及毒力分析等輔助基因組信息。

該例患者以發熱、頭痛為首發癥狀，后續出現皮疹及消化、呼吸道癥狀等全身各系統受累表現，腦脊液檢查僅提示顱壓升高，常規生化示病毒感染樣非化膿性改變，其余檢查無陽性發現，初步診斷為病毒性腦膜炎。但經抗病毒等治療后病情卻未見好轉。后腦脊液mNGS回報恙蟲病東方體，檢出特異性序列數76，綜合測序量、病原體基因組大小、質控分析等維度，同時結合患者職業特點，癥狀及可疑焦痂皮損、顱高壓體征，并除外其他原因所致的CNS損害后，確診為恙蟲病腦膜炎。病程中患者并未發現典型焦痂等特異性表現，依靠臨床常用檢驗及影像學方法亦難與病毒性腦膜炎相鑒別，蘇鳳新等人的研究也報道了恙蟲病易被誤診為病毒性腦膜炎這一情況[14]。若延誤治療時機，病情可能繼續進展，甚至發生全身多器官功能衰竭、彌散性血管內凝血等[15]情況。最終該患者通過mNGS完成診斷，及時獲得有效治療。

在CNS感染方面，mNGS對常見細菌、病毒的檢測比傳統方法陽性率更高[16]，而其對如熱帶念珠菌、狒狒巴拉姆希阿米巴等罕見或新發病原體的檢測方面則更有價值，能顯著提高確診概率[17]。mNGS檢出特異性序列數也存在參考價值，例如對于DNA病毒性腦膜炎/腦炎，檢出序列數越高對診斷意義越大[18]。但在對mNGS應用過程中，仍發現其不足之處：(1)費用昂貴，難以通過復查監測感染變化情況;(2)需及時取材，標本保存時間過長或經歷多次凍融循環可能降低診斷效能;(3)標本污染、背景微生物的存在會影響結果判讀;(4)基因組比對、質控等過程中可能出現數據分析誤差;(5)檢測結果并無絕對意義，特別對于檢出序列數較低的樣本，需結合臨床情況判讀。

綜上所述，恙蟲病累及CNS發生腦膜炎時，以發熱、頭痛為主要癥狀，并可出現腦膜刺激征陽性，腦脊液檢查正常或呈病毒感染樣非化膿性改變，頭部影像學檢查可無特異性改變。當未見典型焦痂皮損，而病原學檢查又無陽性發現時，非專科醫師可能因忽視患者工作特點、或對恙蟲病等感染性疾病認識不充分等因素，將其誤診為病毒性腦膜炎，從而延誤治療時機。在臨床工作中，通過常規方法未能查明感染情況時，應合理應用mNGS協助明確診斷，才能及時制定針對性的臨床決策，改善患者預后。