正交試驗法與Box-Behnken 響應面法優選白殘花-烏梅藥對提取工藝比較*

范玲，唐佳蒙，王鑫，吳怡雯，金慶江，王深軍，陳國新△

（1.江蘇省蘇州市中西醫結合醫院，江蘇 蘇州 215101；2.南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 南京 225300）

白殘花-烏梅是臨床常用于治療口舌生瘡、口腔潰瘍的經典藥對［1］。白殘花是薔薇科植物野薔薇RosamultifloraThunb.的干燥花，具有保肝［2］、抗炎、抑菌［3］、抗病毒、抗腫瘤［4］等功效，主要活性成分為三萜類（如熊果酸、齊墩果酸［5］）、黃酮類（如金絲桃苷、槲皮素［6］）、多糖等。烏梅是薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc 的干燥近成熟果實，主要活性成分為有機酸（如枸櫞酸［7］）、三萜類、甾醇［8］等，具有抑菌［9］、鎮咳［10］、鎮靜催眠、抗驚厥［11］等功效。現代藥理學研究表明，烏梅對桿菌、球菌等均有較強抑制作用，與白殘花相須為用，效果更甚。本研究中以綜合金絲桃苷含量及提取液的浸膏得率所得綜合評分為評價指標，采用正交試驗法和響應面法優選了白殘花-烏梅藥對的提取工藝，并將2種方法進行比較。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FA2004B 型電子天平（上海越平科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；DW -2 型調溫電熱套（通州區張芝山鎮決也化工電器廠）；KQ5200 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；液相用溶劑過濾器；GM-0.33A 型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號為19050906，純度不低于98%）；乙腈（色譜純，上海展云化工有限公司）；其余試劑均為分析純，試驗用水為娃哈哈純凈水；白殘花（批號為210311010），烏梅（批號為210225010），均購于蘇州天靈中藥飲片有限公司，經江蘇省蘇州市中西醫結合醫院于棟偉主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 金絲桃苷含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent EC -C18柱（150 mm × 4.6 mm，4μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；洗脫時間：25 min；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間有色譜峰出現，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

取金絲桃苷對照品14.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加100%甲醇溶解并定容，搖勻，制成對照品貯備液。精密量取對照品貯備液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加100%甲醇溶解并定容，搖勻，即得每1 mL含金絲桃苷56μg 的對照品溶液。按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，置合適的圓底燒瓶內，按正交試驗和響應面試驗設計的各序列號下的條件，加水適量，回流煎煮，提取，4 層紗布過濾，合并得水煎液，冷卻后記錄體積；精密量取水煎液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，加100%甲醇溶解，用10 mL容量瓶定容，0.45μm 微孔有機過濾器濾過，即得供試品溶液。稱取烏梅藥材10 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取2.1.2 項下對照品溶液，稀釋成質量濃度分別為56.00，14.00，11.20，5.60，1.12 μg/mL 的系列對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=38.42X-11.01，R2=1.000 0（n=5）。結果表明，金絲桃苷質量濃度在1.12～56.00μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取2.1.2項對照品溶液適量，加100%甲醇逐級稀釋，按2.1.1項色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）為3∶1 時的質量濃度為檢測限，以S/N為10∶1時的質量濃度為定量限。結果檢測限和定量限分別為0.113 2μg/mL和0.372 3μg/mL。

精密度試驗：精密量取線性關系考察項下對照品溶液（質量濃度為11.20μg/mL），按2.1.1項下色譜條件，于同日內進樣測定6 次；每日連續進樣測定2次，連續測定3 d。結果峰面積的RSD分別為0.34%和0.96%（n=6），表明儀器日內精密度和日間精密度均良好。

穩定性試驗：取正交試驗序列表中的5 號水煎液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為0.56%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取正交試驗序列表中的5 號水煎液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，共6份，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為0.78%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取正交試驗序列表中的5號水煎液10 mL，共6份，分別置已干燥至恒重的蒸發皿中，蒸干，加100%甲醇溶解，用10 mL容量瓶定容，精確加入金絲桃苷對照品0.13 mg，超聲使溶解，搖勻，0.45μm微孔有機過濾器濾過，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果平均加樣回收率為96.53%，RSD為1.79%（n=6）。

2.2 浸膏得率

分別取正交試驗和響應面試驗各組水煎液5 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，置105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，放入干燥器中冷卻0.5 h，得白殘花-烏梅藥對提取物的干浸膏，計算浸膏得率。

式中，l為水浴濃縮的提取液體積；L為煎煮后提取液的總體積；m為煎煮飲片的總質量；m1為蒸發皿質量；m2為含提取液的蒸發皿質量。

2.3 單因素試驗

以提取液中金絲桃苷含量為主要指標［12-13］，同時計算浸膏得率，進行單因素考察，并計算綜合評分。

加水量：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共5份，分別置合適的圓底燒瓶內，加入10，15，20，25，30倍量水，加熱回流1.0 h，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下方法制備干浸膏，按公式2）計算綜合評分。結果加入10～25倍量水時，綜合評分呈遞增趨勢；加入30 倍量水時，綜合評分降低。故選擇加25倍量水，詳見圖2 A。

提取時間：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共4份，分別置合適的圓底燒瓶內，加入25 倍量水，分別回流煎煮0.5，1.0，1.5，2.0 h，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下方法制備干浸膏，按公式2）計算綜合評分。結果提取1.0 h時，綜合評分為100.00分。故選擇提取1.0 h，詳見圖2 B。

提取次數：按處方比例2∶1（m/m）稱取藥材白殘花10 g、烏梅5 g，共3份，分別置合適的圓底燒瓶內，加入25 倍量水，回流提取1.0 h，分別提取1 次、2 次、3次，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下方法制備干浸膏，按公式2）計算綜合評分。結果綜合評分隨提取次數的增加而增加。故選擇提取3次，詳見圖2 C。

2.4 正交試驗優選提取工藝

按單因素試驗結果，以加水量（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）為考察因素，以綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗［14-16］優選提取工藝。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and their levels of the orthogonal test

由表2 中極差R值可知，各因素對綜合評分的影響順序由大至小依次為提取次數>提取時間>加水量。采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據，P<0.05為差異有統計學意義。方差分析結果見表3。可見，提取次數對綜合評分影響顯著，加水量和提取時間對其影響不顯著。比較3個影響因素的K1，K2，K3的大小，選定A1B2C3為最佳提取工藝，即加20倍量水，提取3次，每次1.0 h。通過試驗驗證，得到綜合評分為90.28分（RSD=1.68%）。

表2 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 正交試驗方差分析結果Tab.3 Results of ANOVA of the orthogonal test

2.5 響應面試驗優選提取工藝

2.5.1 因素與水平

按單因素試驗結果，并結合Box -Behnken 響應面法的原理進行設計，以加水量（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）為自變量，以綜合評分為響應值，采用Box -Behnken 響應面法［17-19］優選提取工藝。因素與水平見表4。

表4 Box-Behnken響應面試驗因素與水平Tab.4 Factors and their levels of the BBD-RSM

2.5.2 試驗設計與結果

Box-Behnken響應面試驗設計與結果見表5。

2.5.3 模型建立與顯著性分析

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件分析表5中17組試驗數據，P<0.05為差異有統計學意義。得到二元回歸方程Y=94.61+2.15A-0.024B+12.85C-0.43AB-4.56AC+0.25BC-3.76A2-0.024B2-7.02C2。其中，A，B，C系數的大小反映該因素對金絲桃苷綜合評分影響的大小和方向。方差分析結果見表6。可見，該模型的F=11.34，顯著性水平為P<0.01，具有統計學意義；模型的失擬項F=1.34，顯著性水平為P=0.379 3>0.05，此項不顯著。所有數據充分顯示了該模型的回歸效果顯著，有較好的擬合度及很高的預測準確度，故此模型可用于表示響應值與自變量間的多元回歸關系。由表6中F值和顯著水平P值可知，一次項中僅因素C（提取次數）有顯著性（P<0.05），提取時間和加水量的差異均無顯著性（P>0.05），且3種影響因素的相互作用無意義；由F值可知，因素C（提取次數）>因素A（加水量）>因素B（提取時間）為各個自變量對綜合評分的影響順序，3個交互項的偏回歸系數均不顯著（P>0.05），表明加水量、提取時間、提取次數3個影響因素的交互項對綜合評分影響均不顯著（P>0.05）。二次項中僅C2（提取次數和提取次數的交互作用）差異有顯著性（P<0.05），其余均無顯著性（P>0.05）。

表5 Box-Behnken響應面試驗設計與結果Tab.5 Design and results of the BBD-RSM

表6 Box-Behnken響應面試驗方差分析結果Tab.6 Results of ANOVA of the BBD-RSM

2.5.4 響應面交互作用分析

在3 個影響因素中，取任意2 個因素分別作為X軸和Y軸，以綜合評分作為Z軸，采用Design -Expert 8.0.6.1 軟件創建兩因素交互作用對綜合評分影響的三維響應面圖（圖3）。在響應面圖中，曲面越陡峭，則該因素對所測得含量的影響越大［20］。

可見，綜合評分隨提取次數、加水量的增加而升高，其響應面圖形表現得相對陡峭，且等高線輪廓近似橢圓形，表明兩因素間的相互作用相對較強（圖3 B）；而加水量和提取時間（圖3 A）、提取時間和提取次數（圖3 C）的響應面圖形表現的曲線較平滑，表明這些因素相互作用的影響不明顯。由圖3 A 可知，綜合評分隨提取時間和加水量的增大呈現緩慢升高-降低趨勢，但變化較小。由圖3 B可知，當提取次數為1～2次時，綜合評分隨加水量的增大而呈現逐漸升高-降低趨勢；當提取次數達2次以上時，綜合評分隨加水量的變化而呈現緩慢增加趨勢；當加水量為20～25倍時，綜合評分隨提取次數的增加而明顯升高；當加水量達25 倍以上時，綜合評分隨提取次數的變化而呈現緩慢升高-降低趨勢。由圖3 C 可知，當提取時間為0.5～1.0 h時，綜合評分隨提取次數的增加而明顯升高；當提取時間達1.0 h以上時，綜合評分隨提取次數的增大而呈現升高-降低趨勢；當提取次數為1～3次時，綜合評分隨提取時間的增加而呈現非常緩慢的升高趨勢，變化較小。可見，加水量和提取次數對金絲桃苷綜合評分的影響較強，提取時間對其影響較弱，但也有一定作用。

2.5.5 最佳條件確定及驗證試驗

通過Design -Expert 8.0.6.1 軟件求解回歸方程，得到白殘花-烏梅藥對的最佳提取條件為加26.67 倍量水，提取2.65次，每次0.99 h，在此提取條件下所得理論綜合評分為99.47分。根據實際情況將上述提取工藝修正為加25 倍量水，提取3次，每次1.0 h。平行3 次試驗所得的綜合評分為97.85 分（RSD=1.52%），表明建立的模型和實際情況基本吻合。

3 討論

3.1 考察指標選擇

白殘花-烏梅藥對對口舌生瘡、口腔潰瘍的治療作用是數個物質共同作用的結果。其中，金絲桃苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等活性，是白殘花藥材的有效成分之一，故應選擇浸膏得率、金絲桃苷含量等作為研究指標。在衡量分配系數時，金絲桃苷含量占0.7，浸膏得率占0.3。使用多指標的綜合評分法避免了單一指標的片面性，可以全面地分析多種指標，且側重主要的影響因素，使分析結果更加客觀。

3.2 正交試驗法與響應面法比較

正交試驗中，提取次數對綜合評分的影響顯著（P<0.05），而加水量、提取時間對其影響不顯著（P>0.05）；但響應面試驗分析顯示，加水量和提取次數有較強的交互影響，對綜合評分的影響較大。比較這2種方法，響應面法可更好地表示響應值與多因素的關系，尤其是這些因素相互間也有影響。正交試驗法優選出的最佳提取工藝為加20 倍量水，提取3次，每次1.0 h，綜合評分為90.28分；Box-Behnken響應面法優選出的最佳提取工藝為加25 倍量水，提取3次，每次1.0 h，綜合評分為97.85 分。故Box -Behnken 響應面法更適合提取白殘花-烏梅藥對。