CERKL通過激活SIRT1/E2F1軸減輕藍光導致的人視網膜色素上皮細胞氧化應激損傷

莊海容，吳子東，陳雪紅，李成軍

0引言

隨著科技的發(fā)展與電子產品的廣泛使用，人們越來越重視藍光輻射對視網膜的危害。視網膜色素上皮(RPE)位于視網膜最外層，在維持光感受器功能和結構方面起著極為重要的生理作用[1]。大量證據(jù)顯示，持續(xù)藍光暴露會誘發(fā)RPE細胞凋亡，而RPE細胞中自身代謝產物的積累很容易引發(fā)氧化應激，導致光感受器功能受損，嚴重危害視力健康[2-3]。神經酰胺類似蛋白(CERKL)是導致視網膜退化的重要致病基因[4-5]。Mandal等[6]研究發(fā)現(xiàn)藍光可誘導RPE中CERKL的表達。Riera等研究表明，CERKL可以使視網膜細胞形成氧化應激保護[7]。由此推測：CERKL可能通過調節(jié)細胞內的氧化應激途徑來保護視網膜組織免受藍光損傷，但該推測的正確性與其中的分子機制仍有待進一步研究。沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)是機體內重要的去乙酰化酶，與不同的底物結合可發(fā)揮多重作用，例如：抗炎、抗氧化應激與抗凋亡等。有報道顯示，視網膜細胞內的CERKL能夠通過與SIRT1相互作用，來穩(wěn)定SIRT1蛋白的表達[8]。最新研究指出，SIRT1可以介導RPE細胞中E2F轉錄因子1(E2F1)的去乙?；?，而E2F1在RPE細胞抗氧化應激中發(fā)揮了重要作用[9]。由此推測，CERKL可能通過調控SIRT1/E2F1軸來保護RPE細胞免受藍光誘發(fā)的氧化應激損傷。本文通過人視網膜色素上皮-19(ARPE-19)細胞體外培養(yǎng)實驗探究了CERKL與SIRT1/E2F1軸參與藍光損傷保護的機制，現(xiàn)將其報告如下。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19細胞購自美國ATCC，DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RIPA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、脂質氧化檢測試劑盒購自上海碧云天生物，CERKL抗體(#ab222828)、SIRT1抗體(#12193)與E2F1抗體(#ab137415)均購自英國Abcam公司，乙?；腅2F1抗體(乙?；疞ys120，#ABP57453)購自武漢艾美捷科技，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen，MTT試劑購自德國羅氏診斷，TUNEL顯色法凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物，10%甲醛購自上海威奧生物，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)檢測試劑盒購自上海澤葉生物，山羊血清購自武漢博士德，TritonX-100購自德國Sigma。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)ARPE-19細胞使用含有10%的胎牛血清、100μg/mL鏈霉素與100U/mL青霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)，于5% CO2、37℃的恒溫加濕的細胞培養(yǎng)箱(HWS-250B，天津泰斯特公司)中培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2藍光照射將ARPE-19細胞使用胰蛋白酶處理后，以1.5×104個/孔接種于4孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至融合。細胞在接受藍光暴露前使用磷酸鹽緩沖液清洗3次，隨后以含有鈣、鎂和葡萄糖的磷酸鹽緩沖液代替培養(yǎng)，使用藍光(Zensui LED Lamp BlueTM，日本Zensui公司)LED固定于細胞培養(yǎng)層頂部，照射對應時長(0～24h)，峰值波長為450nm，光強度為1200lx，對照細胞除了不采用藍光照射外(黑暗培養(yǎng))，其余操作均相同。

1.2.3細胞形態(tài)觀察采用相差顯微鏡(FSX-100，日本Olympus)觀察細胞的形態(tài)變化，低倍鏡(40×)下找到細胞，換用高倍鏡(400×)觀察，將視野調節(jié)清晰后拍照，對照與藍光照射細胞各選取3個重復進行拍照分析。

1.2.4細胞轉染采用Lipofectamine 2000轉染試劑將siRNA-NC、siRNA-CERKL、pcDNA3.1、pcDNA3.1-CERKL分別轉染至ARPE-19細胞，轉染48h后采用PCR法驗證轉染成功。其中si-CERKL：5’-GAGAAATACCGATGGATGT-3’,siRNA與pcDNA3.1空質粒與重組質粒載體均由廣州銳博生物提供。

1.2.5mRNA表達量測定細胞接受對應處理后，使用Trizol法提取細胞的總RNA，紫外分光光度計(NanoDrop 1000，美國賽默飛)測定RNA濃度，采用實時熒光PCR儀(ABI7500，美國ABI)進行PCR擴增，以1μg總RNA作為逆轉錄PCR模板合成cDNA，以cDNA作為實時熒光PCR模板擴增，以GAPDH作為內參，采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算mRNA表達量，每樣本檢測3個復孔，計算平均值。

1.2.6蛋白表達量測定采用RIPA試劑裂解細胞，BCA法對蛋白進行定量，取60μg總蛋白進行電泳，轉移至PVDF膜，山羊血清封閉1h后，添加一抗(乙酰化的E2F1抗體稀釋比例為1∶500，其余抗體為1∶1000)于4℃孵育過夜，取出添加二抗(稀釋比例為1∶5000)在室溫下孵育1h，ECL顯影后進行凝膠成像分析，Image J軟件定量分析蛋白的相對表達量，所有處理均設置3個重復，計算平均值。

1.2.7細胞活力測定細胞活力采用MTT法檢測，以1×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中，藍光暴露相應時長后取出細胞，加入每孔20μL的MTT試劑，孵育4h，棄上清，加入150μL的DMSO溶解結晶，酶標儀測定490nm處吸光值，所有處理均設置3個重復，計算平均值。

1.2.8細胞凋亡率檢測采用TUNEL染色測定細胞凋亡情況，使用10%甲醛固定細胞10min，1×平衡緩沖液孵育10min，使用TUNEL顯色法凋亡檢測試劑盒，加入制備好的TUNEL反應混合液，于37℃、黑暗條件下反應1h，終止反應后清洗細胞，以鏈霉素-辣根過氧化物酶覆蓋樣本，DAB顯色，顯微鏡(Fluo ViewTM FV1000，日本Olympus)下觀察TUNEL陽性細胞數(shù)，計算TUNEL陽性細胞比例作為凋亡率，所有處理均設置3個重復，計算平均值。

1.2.9免疫熒光染色將ARPE-19細胞使用甲醛固定10min，隨后使用0.5% TritonX-100滲透15min，用含10%山羊血清的PBS在室溫下封閉1h，一抗(1∶1 000)孵育，4℃過夜，添加二抗(1∶1 000)于37℃孵育1h，DAPI染色5min后，使用激光共聚焦顯微鏡捕獲熒光圖像。

1.2.10氧化應激水平的測定采用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內ROS水平，激發(fā)和發(fā)射波長分別設置為485nm和528nm，使用流式細胞儀(CytoFLEX，美國貝克曼庫爾特)分析；采用脂質氧化檢測試劑盒測定細胞內丙二醛(MDA)含量，代表脂質過氧化水平；采用8-OHdG檢測試劑盒與酶標儀(熱電FC，美國賽默飛)測定8-OHdG的含量。所有處理均設置3個重復，計算平均值。

2結果

2.1藍光照射后ARPE-19細胞形態(tài)的變化在正常條件下，ARPE-19細胞始終呈現(xiàn)長軸形狀，隨著時間推移只存在輕微的變化；而采用藍光照射后，ARPE-19細胞逐漸收縮變?yōu)闄E圓形，同時出現(xiàn)空泡(圖1)，表明藍光照射對ARPE-19細胞產生了毒性。

圖1 藍光照射后ARPE-19細胞形態(tài)的變化 相差顯微鏡下觀察有無藍光(BL)照射的ARPE-19細胞形態(tài)變化。

2.2藍光照射對ARPE-19細胞CERKL表達的影響藍光照射一段時間后，ARPE-19細胞中應激蛋白CERKL的mRNA與蛋白質表達量均呈現(xiàn)增加趨勢，與藍光照射0h比較，藍光照射6h后CERKL的mRNA與蛋白質達到高峰(t=18.980、14.470，均P<0.001)，12h與24h仍維持在較高水平(mRNA:t=10.920、4.021，P<0.001、=0.016；蛋白質：t=13.690、6.682，P<0.001、=0.003)，見圖2。因此后續(xù)實驗中藍光暴露時長設置為24h。

圖2 藍光照射對ARPE-19細胞CERKL表達的影響 A：藍光照射24h內細胞CERKL mRNA表達的變化；B：藍光照射24h內細胞CERKL蛋白質表達的變化。

2.3CERKL表達對藍光照射導致的ARPE-19細胞氧化應激損傷的影響與對照細胞比較，藍光照射24h后細胞CERKL表達量升高(t=10.890,P<0.05，圖3A)，相對細胞活力隨著時間推移逐漸降低(F=69.550,P<0.001，圖3B)，凋亡率升高(t=15.610,P<0.001，圖3C)，ROS、MDA、8-OHdG含量升高(t=20.590、17.940、22.130,均P<0.001，圖3D～F)；在藍光照射的基礎上，采用siRNA-CERKL抑制CERKL表達會加劇這種變化，表現(xiàn)為6、12、24h細胞相對活力的降低(t=6.286、6.609、5.826,P=0.003、0.003、0.004，圖3B)，凋亡率升高(t=6.940,P=0.002，圖3C)，ROS、MDA、8-OHdG含量升高(t=13.610、19.770、18.350,均P<0.001，圖3D～F)；而在藍光照射的基礎上，采用pcDNA3.1-CERKL上調CERKL表達則能逆轉此變化，表現(xiàn)為6、12、24h細胞相對活力的恢復(t=3.836、8.385、8.980,P=0.019、0.001、<0.001，圖3B)，凋亡率降低(t=9.584,P<0.001，圖3C)，ROS、MDA、8-OHdG含量降低(t=8.485、10.640、22.020,P=0.001、<0.001、<0.001，圖3D～F)。上述結果提示，上調CERKL能緩解藍光照射導致的ARPE-19細胞氧化應激損傷，提高細胞存活率。

圖3 CERKL表達對藍光照射導致的ARPE-19細胞氧化應激損傷的影響 A：各組CERKL mRNA表達；B：MTT法測定細胞活力；C：TUNEL染色檢測細胞凋亡；D：流式細胞儀測定細胞中ROS含量；E：各組MDA含量；F：各組8-OHdG含量。

2.4CERKL與SIRT1/E2F1軸的關系免疫熒光染色分析顯示，CERKL與SIRT1在ARPE-19細胞的細胞質和細胞核中共同定位(圖4A)；藍光照射增加了SIRT1表達(t=12.810,P<0.001)，誘導E2F1的脫乙酰化(t=3.252,P=0.031)，抑制CERKL減少了藍光照射下細胞的SIRT1表達(t=14.170,P<0.001)，并增強了E2F1乙酰化程度(t=10.190,P<0.001)，而上調CERKL又可增強藍光照射下細胞的SIRT1表達(t=18.060,P<0.001)，促進E2F1的脫乙酰化(t=6.383,P=0.003)，見圖4B～D。以上提示，上調CERKL能激活SIRT1/E2F1軸。

圖4 CERKL與SIRT1/E2F1軸的關系 A：免疫熒光染色對ARPE-19細胞中CERKL與SIRT1進行定位；B:各組SIRT1、乙酰化E2F1與E2F1蛋白表達情況；C：各組SIRT1表達情況；D：各組乙?；疎2F1/E2F1表達情況。

2.5沉默SIRT1對CERKL緩解藍光誘發(fā)ARPE-19細胞氧化應激損傷作用的影響為證實CERKL是否通過調控SIRT1軸對藍光照射下的ARPE-19細胞產生保護作用，分別將pcDNA3.1-CERKL與siRNA-SIRT1轉染ARPE-19細胞，藍光照射24h。轉染pcDNA3.1-CERKL上調CERKL表達(藍光vs藍光+pc-CERKL:t=15.780,P<0.001)，采用siRNA-SIRT1沉默了SIRT1的表達(藍光vs藍光+si-SIRT1:t=16.560,P<0.001,藍光+pc-CERKLvs藍光+pc-CERKL+si-SIRT1：t=22.040,P<0.001)，但不影響CERKL的表達量(藍光+pc-CERKLvs藍光+pc-CERKL+si-SIRT1：t=0.389,P=0.717)，見圖5A，表明轉染成功。結果顯示，單獨沉默SIRT1或在上調CERKL表達的基礎上沉默SIRT1，均會導致6、12、24h的細胞活力降低(藍光vs藍光+si-SIRT1：t=6.815、8.578、5.362，P=0.002、0.001、0.006;藍光+pc-CERKLvs藍光+pc-CERKL+si-SIRT1：t=3.836、8.385、9.329,P=0.019、0.001、<0.001，圖5B)，細胞凋亡率升高(藍光vs藍光+si-SIRT1：t=6.940,P=0.002，藍光+pc-CERKLvs藍光+pc-CERKL+si-SIRT1：t=11.680,P<0.001)，見圖5C，ROS、MDA、8-OHdG含量升高(藍光vs藍光+si-SIRT1：t=17.150、27.830、23.520，均P<0.001;藍光+pc-CERKLvs藍光+pc-CERKL+si-SIRT1：t=29.520、10.620、59.870,均P<0.001)，見圖5D～F。以上提示，CERKL通過激活SIRT1軸減輕藍光誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷。

圖5 沉默SIRT1對CERKL緩解藍光誘發(fā)ARPE-19細胞氧化應激損傷作用的影響 A：各組CERKL、SIRT1 mRNA表達；B：MTT法測定細胞活力；C：TUNEL染色檢測細胞凋亡；D：流式細胞儀測定細胞中ROS含量；E：各組MDA含量；F：各組8-OHdG含量。

3討論

藍光造成的視網膜損傷是當前眼科研究的熱點之一。眼睛長時間暴露于各類可見光中，其中以波長在400～450nm的藍光對眼睛危害最大[10-11]。本研究探討了CERKL/SIRT1/E2F1分子軸參與藍光誘發(fā)的ARPE-19細胞氧化應激損傷的機制，以期為藍光損傷干預提供潛在的分子靶點。結果發(fā)現(xiàn)，藍光照射后的ARPE-19細胞逐漸收縮成圓球狀，且出現(xiàn)空泡，表明藍光對細胞產生了毒害作用。Takayama等[12]研究發(fā)現(xiàn)，藍光暴露會導致ROS的增加，并通過氧化應激導致RPE細胞凋亡，并指出這可能是導致視網膜結構損傷的重要途徑。本研究觀察到藍光照射后ARPE-19細胞活力降低，凋亡率升高，ROS、MDA、8-OHdG的含量均顯著升高。ROS的過度積累會造成細胞內的氧化應激損傷、脂質過氧化物MDA與DNA損傷標志物8-OHdG釋放增多，最終導致細胞死亡[13]。

CERKL在眼部視網膜組織中大量表達，并被報道為視網膜色素病變的致病基因[14]。多國研究發(fā)現(xiàn)，CERKL的突變會導致視網膜色素性病變[5,15-16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在藍光照射后的不同時間點，CERKL表達水平均有不同程度的升高。隨后通過質粒轉染調節(jié)ARPE-19細胞內CERKL表達，結果顯示沉默CERKL會加劇藍光誘發(fā)的細胞氧化應激損傷與凋亡，而上調CERKL則能緩解藍光損害，表明CERKL能抑制ARPE-19細胞內的氧化應激與凋亡，提高細胞存活率。

SIRT1是細胞內關鍵的氧化還原調節(jié)因子，而E2F1是重要的轉錄激活因子，SIRT1可以通過結合E2F1抑制其誘凋亡的活性，同時通過使E2F1脫乙酰化促進細胞內的抗氧化因子轉錄，清除細胞內因藍光暴露積累的ROS，保護細胞免受ROS誘發(fā)的凋亡，提高細胞的存活率[17-18]。本研究結果證實：上調CERKL增加了SIRT1表達，促進了E2F1脫乙?；?，沉默SIRT1能逆轉CERKL緩解藍光誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷。Li等[19]研究指出CERKL可以通過與線粒體中的硫氧化還原蛋白2的相互作用，減少ROS誘發(fā)的氧化應激與凋亡。García-Arroyo等[4]研究證明CERKL可以通過調控線粒體大小與形狀，減輕RPE細胞內的氧化應激。與上述研究共通之處是，本研究中發(fā)現(xiàn)的CERKL下游靶點SIRT1也廣泛存在于線粒體中，因此CERKL也是通過與線粒體蛋白的作用來清除ROS；不同的是，本研究中揭示了CERKL激活SIRT1/E2F1軸，促進抗氧化因子轉錄的信號傳導機制，豐富了對CERKL參與調控視網膜細胞氧化應激機制的認識，說明了CERKL保護視網膜RPE細胞的機制是復雜且多通路的。

綜上所述，CERKL可以通過激活SIRT1蛋白表達，促進E2F1的脫乙?；?，從而減輕藍光誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷，隨著日后研究的深入，CERKL/SIRT1/E2F1軸可能成為視網膜光損傷的干預靶點。