AG3340對高糖誘導人視網膜色素上皮細胞遷移和侵襲的影響

鄭 磊，張國明，陳妙虹，馬大卉

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和最嚴重的并發癥之一，合并有黃斑水腫或進展為增殖期通常會對患者的視功能造成不可逆損害，目前DR已成為全球范圍內最常見的致盲性疾病之一。纖維增生膜的產生是DR晚期的基本病理表現之一，可引起牽拉性視網膜脫離，臨床處理相對棘手，因此阻止DR進展及纖維增生膜形成一直是研究的熱點。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層介于視網膜神經上皮層和脈絡膜之間，容易受到血糖波動的影響，大量研究已證實視網膜微環境持續高糖水平會影響RPE細胞功能而參與介導DR發病進展，如高糖環境會誘導RPE細胞凋亡，破壞視網膜外屏障而加劇水腫和滲出[1]、高糖環境會導致RPE細胞分泌大量炎癥因子，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β和IL-6促進DR進展[2]等。而最近的研究還發現高糖可以增強RPE細胞的遷移能力[3-4]，可能參與DR纖維膜的形成，并且與RPE細胞內基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)的活化有關[5]。AG3340(普啉司他)是一種廣譜的MMPs合成抑制劑，已被證實可用于抑制多種惡性腫瘤細胞的轉移和侵襲[6]。近年研究發現，AG3340還可以拮抗部分眼底新生血管的形成[7-9]，但目前尚缺乏AG3340在DR中的研究。本研究擬通過體外高糖條件下培養RPE細胞，探究AG3340對高糖狀態下RPE細胞遷移和侵襲能力的影響及相關機制，以期為抑制晚期DR纖維膜的產生提供新的實驗依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞人視網膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelial cells-19，ARPE-19)購自美國模式培養細胞物研究所(ATCC公司)。

1.1.2主要實驗試劑和儀器DMEM/F12培養基、2.5g/L胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(中美合資蘭州民海生物)，二甲基亞砜(DMSO)、AG3340(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，基質膠Matrigel(美國BD公司)，MMP-9(ab228402)、MMP-2(ab92536)、Fibronectin(ab268021)及Collagen Ⅳ抗體(ab182744，英國Abcam公司)。微量加樣器(德國Eppendorf公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Odyssey雙色紅外成像系統(美國Licor公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養ARPE-19細胞常規培養于含10% FBS的DMEM/F12培養基(含1%青-鏈霉素)，培養箱內溫度為37℃，CO2體積分數為5%，每3d傳代1次，取對數期生長的細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組將ARPE-19細胞分為4組進行培養：(1)對照組(Control組)：含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養基培養；(2)高糖(high glucose，HG)組：含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養基培養；(3)HG+AG3340組：用MMPs抑制劑AG3340預處理細胞12h后，再添加含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養基培養；(4)甘露醇(mannitol，MA)組：含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培養基培養，作為滲透壓對照組。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移取對數期生長的ARPE-19細胞，制成細胞懸液，計數，以2×105個/孔鋪于6孔板中，待細胞匯合度達90%以上，以200μL槍頭垂直于6孔板底部劃直線，人為制造細胞間距；用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，按照分組方案每孔加入等量培養液2mL繼續培養細胞。分別在0、24、48h使用倒置顯微鏡隨機選取3個視野拍照，用Image J軟件測量劃痕寬度。細胞遷移能力采用遷移率表示，細胞遷移率=(原劃痕寬度-現劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell小室檢測細胞侵襲取對數期生長的ARPE-19細胞，制成細胞懸液，計數，以2×105個/孔鋪于6孔板中，待細胞貼壁后，按照分組方案每孔加入等量培養液2mL繼續培養細胞48h；去除原培養基，PBS清洗1次，取少量胰蛋白酶消化并收集細胞；PBS清洗細胞3次，計數，重懸于無血清DMEM/F12培養基中；Transwell小室在加入細胞懸液前，需用Matrigel膠預先包被小室底部膜的上室內面，置于24孔板內，再于上室中加入細胞密度為1×105cell/mL的細胞懸液100μL，下室加入500μL含FBS的培養基，置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養48h；待終止培養后，取出小室，用棉簽輕輕拭去上室內層未發生侵襲的細胞，4%多聚甲醛固定5min，0.2%結晶紫染色8min，清水洗去多余結晶紫，晾干后置于倒置顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，并計數發生侵襲的細胞數目。

1.2.5Westernblot檢測相關蛋白表達水平按照分組處理ARPE-19細胞48h后收集細胞，PBS洗滌，并用RIPA裂解緩沖液溶解，4℃以13 000r/min離心10min。上清液蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h。MMP-9(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、Fibronectin(1∶500)及Collagen Ⅳ(1∶500)一抗孵育，加入相應比例的熒光二抗，避光孵育1h，并使用LICOR-Odyssey儀器掃膜分析。

2結果

2.1AG3340抑制高糖誘導的ARPE-19細胞遷移能力細胞劃痕實驗發現，各組在劃痕24h后的細胞遷移率總體比較差異具有統計學意義(F=72.02，P=0.001)；MA組細胞遷移率(20.91%±0.92%)與Control組(21.00%±0.81%)相比差異無統計學意義(t=0.37，P=0.42)；HG組細胞遷移率(46.33%±7.76%)明顯高于Control組，差異具有統計學意義(t=0.29，P<0.001)；采用2.5、5.0、10.0μg/mL AG3340預處理后，細胞遷移率分別為38.33%±3.51%、33.50%±2.29%、33.00%±2.01%，均較HG組降低，差異有統計學意義(t=2.74、0.59、3.18，均P<0.01)。各組在劃痕48h后的細胞遷移率總體比較差異具有統計學意義(F=109.78，P<0.001)；MA組細胞遷移率(31.33%±1.49%)與Control組(31.67%±1.53%)相比差異無統計學意義(t=0.62，P=0.35)；HG組細胞遷移率(67.00%±1.73%)明顯高于Control組，差異具有統計學意義(t=1.45，P<0.001)；采用2.5、5.0、10.0μg/mL AG3340預處理后，細胞遷移率分別為54.67%±2.52%、47.00%±7.07%、47.33%±17.24%，均較HG組降低，差異有統計學意義(t=0.56、4.16、0.27，均P<0.01)。在劃痕24、48h后AG3340 5.0μg/mL預處理的細胞遷移率均明顯低于AG3340 2.5μg/mL預處理的細胞，差異具有統計學意義(均P<0.05),但與AG3340 10μg/mL預處理的細胞對比，差異無統計意義(均P>0.05)，見圖1。因此后續實驗均選擇5.0μg/mL作為AG3340預處理濃度。

圖1 細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 A：劃痕實驗細胞遷移圖；B：各組細胞遷移率統計圖。

2.2AG3340抑制高糖誘導的ARPE-19細胞侵襲能力Transwell小室實驗發現，各組細胞侵襲數目總體比較差異具有統計學意義(F=104.97，P<0.001)；MA組細胞侵襲數目(108.33±10.40個)與Control組(109.31±5.73個)相比差異無統計學意義(t=0.53，P=0.30)；HG組細胞侵襲數目(336.00±22.55個)明顯多于Control組，差異具有統計學意義(t=0.87，P<0.001)；采用AG3340預處理后，細胞侵襲數目(238.67±13.89個)較HG組減少，差異具有統計學意義(t=0.29，P<0.01)，見圖2。

圖2 Transwell小室檢測各組細胞的侵襲能力 A：Transwell小室細胞侵襲圖；B：各組細胞侵襲數目統計圖。bP<0.01 vs Control組; dP<0.01 vs HG組。

2.3AG3340拮抗高糖誘導的ARPE-19細胞中相關蛋白表達Western blot檢測結果顯示，各組細胞中MMP-9、MMP-2、Fibronectin及Collagen Ⅳ蛋白相對表達量總體比較差異有統計學意義(F=89.72、49.43、50.06、76.64，均P<0.001)。MA組MMP-9、MMP-2、Fibronectin及Collagen Ⅳ蛋白相對表達量與Control組相比差異無統計學意義(t=1.43、0.29、0.48、3.33，均P>0.05)；與Control組相比，HG組細胞MMP-9和MMP-2相對表達量增加，Fibronectin和Collagen Ⅳ相對表達量減少，差異均具有統計學意義(t=3.06、3.73、2.46、0.34，均P<0.001)。采用AG3340預處理后，細胞中MMP-9和MMP-2蛋白相對表達量均較HG組降低，Fibronectin和Collagen Ⅳ相對表達量均較HG組增加，差異具有統計學意義(t=1.14、6.21、0.49、3.70，均P<0.05)，見圖3，表1。

表1 各組細胞中相關蛋白的表達

圖3 Western blot 檢測各組細胞內相關蛋白的表達。

3討論

DR是目前全世界范圍內工作年齡人群第一位的致盲性疾病，根據病變嚴重程度可分為非增殖性DR(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，后者是DR的相對晚期階段[10]。PDR在我國糖尿病患者人群中的比例約為3.3%～7.4%[11]。纖維增生組織、纖維增生膜的產生是PDR的基本病理表現之一，由此可產生牽拉性視網膜脫離等一系列嚴重并發癥，損害患者的視功能[12]。如何抑制纖維增生膜的形成是挽救PDR患者視功能的關鍵。

目前關于PDR纖維化的形成機制尚無定論，復雜多樣的病理因素交織在一起形成網絡，相互影響，促進PDR纖維化的發生[13]。研究發現PDR纖維增生膜中的主要細胞成分包括RPE細胞和神經膠質細胞等[14]，其中RPE細胞作為血-視網膜屏障的組成部分之一，承擔著維護視網膜內環境穩態的重要作用，其功能紊亂與很多視網膜疾病存在關聯[15]。由于RPE細胞緊鄰脈絡膜毛細血管層，其非常容易受到體內血糖濃度的影響。Farnoodian等[3]研究證實高糖會誘導體外培養的RPE細胞遷移能力明顯增強，與增加氧化應激反應和色素上皮衍生因子的表達有關。Che等[4]也發現高糖會通過誘導RPE細胞的上皮-間質轉化而促進細胞遷移。本研究使用30mmol/L葡萄糖刺激ARPE-19細胞，證實高糖不僅可以增加細胞的遷移能力，同時局部侵襲能力也明顯增強。而RPE細胞一旦離開其自然位置后，會化生為巨噬細胞或成纖維樣細胞，獲得較強的分裂增生能力，并可以產生和分泌膠原或其他細胞外基質(extra-cellular matrix，ECM)成分，促進眼內纖維膜的形成[16]。因此，有效抑制高糖狀態下RPE細胞遷移，對于遏制纖維增生膜的形成和阻止DR的進展至關重要。

MMPs家族是一組金屬離子依賴的結構和功能同源的內肽酶家族，能降解ECM的多種蛋白成分，是促進細胞遷移和侵襲最重要的蛋白家族之一[17]。大量研究已證實，在PDR患者的玻璃體液和增生膜中MMPs表達明顯增加[14，18-20]。這些MMPs來自于不同類型的細胞，包括血管內皮細胞、膠質細胞、RPE細胞等[21]。本研究發現，持續高糖環境使得ARPE-19細胞中的Fibronectin和Collagen Ⅳ降解明顯，前者是ECM和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白，在細胞黏附中起核心作用；后者則構成ECM的骨架。二者的降解勢必會導致高糖環境下ARPE-19細胞遷移和侵襲能力增強。而高糖狀態下ARPE-19細胞中MMP-2和MMP-9的表達明顯上調，也證實了此種病理環境中ECM的降解確實與MMPs的活化有關。

AG3340是一種廣譜的、有效的MMPs抑制劑，可以有效抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9等[22]。AG3340已被證實對多種腫瘤細胞具有良好的抗癌效應，如黑色素瘤、人結腸癌、人胰腺癌、乳腺癌等，其作用機制與AG3340可以抑制腫瘤新生血管形成、腫瘤轉移等相關[23]。此外，AG3340除了具有抗腫瘤效應，在眼科部分疾病中也被證實可能具有一定的治療效用。既往研究報道AG3340可以降低外傷性增生性玻璃體視網膜病變(perliferative vitreoretinopathy，PVR)動物模型中牽拉性視網膜脫離發生的數量和比例，其機制可能與AG3340抑制PVR形成過程中MMPs的形成有關[5-6]。另有研究證實AG3340可以抑制動物模型中視網膜前膜(epiretinal membrane，ERM)的形成[24]。Garcia等[7]和Barnett等[8]發現無論是經腹腔注射或經玻璃體注射AG3340均可以顯著抑制氧誘導視網膜病變(oxygen induced retinopathy，OIR)小鼠模型中視網膜新生血管的形成[7-8]。El Bradey等[9]報道經玻璃體腔內注射AG3340可以明顯降低激光誘導的脈絡膜新生血管兔模型新生血管滲漏的比例。上述研究證實，AG3340抑制MMPs在多種眼部疾病中具有應用價值，但對于AG3340是否會抑制PDR纖維增生膜的形成目前仍缺乏報道。本研究發現，用AG3340預處理ARPE-19細胞可以部分逆轉高糖誘導的細胞遷移和侵襲能力增加，其潛在機制可能與AG3340抑制細胞中MMP-2和MMP-9的表達有關，部分逆轉了高糖環境下細胞周圍ECM組分(Fibronectin和Collagen Ⅳ)的降解，將更多的細胞穩定在其正常的生理位置。

PDR會給患者的視功能帶來極大危害，早期篩查和針對性的視網膜激光光凝可以有效抑制PDR的發生。但由于血糖控制不佳或錯過了早期診治的時間窗，仍有很多NPDR患者會向PDR轉變，尤其是在公共醫療體系不健全的國家。因此尋找其他能夠阻止PDR形成的方法一直是研究熱點。本研究利用體外細胞實驗初步證實AG3340可以部分逆轉高糖誘導的ARPE-19細胞遷移和侵襲，為尋找能夠阻止PDR纖維膜生成及進展的有效藥物提供了思路，但仍需大量動物實驗和臨床數據進行驗證。