鐵皮石斛組織培養研究

蔡正旺

（安康學院，a.電子與信息工程學院；b.現代農業與生物科技學院，陜西 安康 725000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛蘭屬多年生附生草本，喜在半陰半陽的環境中生長，主要分布在中國的南部和西南部［1］，具有較高的藥用價值和經濟價值，是中國傳統名貴中藥材，醫學界稱其為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛自然繁殖力極低［2］，加之人為過度采挖和生境破壞，野生鐵皮石斛已瀕臨絕跡［3］。

以鐵皮石斛種子為材料資源短缺，沒有足夠的材料用于鐵皮石斛的工廠化生產；以原球莖為外植體增殖率比較低，用于規模化生產成本比較高；以莖尖為外植體，大多數是依附于帶芽莖段，單獨以莖尖為外植體的成活率低；以葉片為外植體，葉片分化程度比較高，培養成完整植株的能力比較低，也不適合工廠化生產。國內學者對鐵皮石斛的外植體選擇開展了較多研究，以鐵皮石斛的種子［4］、原球莖［5］、莖尖［6］、幼葉［7］、無菌苗莖段［8，9］等為材料通過增殖、分化、生根培養方式獲得了再生苗或完整植株。

也有文獻報道鐵皮石斛組織培養中的生長調節劑選擇［10-14］、煉苗與栽培管理等［15-17］。為促進秦巴地區產業發展和鄉村振興，探究鐵皮石斛的可持續利用，在當地開展鐵皮石斛快速繁殖技術的研究。以鐵皮石斛莖段為外植體，來源廣、操作簡單，探索適合于規模化生產途徑，助力鐵皮石斛產業鏈的發展。用不同激素組合的培養基進行培養，誘導腋芽、叢生芽的增殖，篩選出最優誘導腋芽和叢生芽增殖的培養基、最適合栽培基質，為鐵皮石斛建立快速繁殖體系提供技術支撐，并選取不同基質對鐵皮石斛進行移栽，篩選鐵皮石斛生長的最適基質。解決鐵皮石斛無菌苗移栽馴化成活率低、種苗品質差、培養周期長的問題，為鐵皮石斛在秦巴地區實現產業化生產提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛盆栽苗來源于云南省德宏芒市繁錦花市。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 將鐵皮石斛苗的枝條整枝剪下，去掉葉片，用洗潔精水浸泡15 min 左右，自來水沖洗干凈后，用刀片切成2~3 cm 長的莖段，75%乙醇滅菌30 s，無菌水沖洗3 次，再用0.1%的氯化汞滅菌10 min 左右，并不斷搖晃燒杯使其滅菌充分，最后將氯化汞倒出后用無菌水沖洗5~6 次備用。

1.2.2 不同生長調節劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導的影響 將滅菌的鐵皮石斛莖段接種在添加不同濃度6-BA 和NAA 的6 種MS 培養基上（表1），每個處理接種12 瓶，每瓶接種3~4 個外植體，每個處理重復3次，培養溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統計腋芽誘導率，觀察腋芽的生長情況，篩選出誘導腋芽的最佳生長調節劑配比。計算公式如下。

表1 鐵皮石斛腋芽誘導培養基生長調節劑組合（單位：mg/L）

1.2.3 不同濃度的香蕉泥對腋芽誘導的影響 在培養基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 中加入不同濃度的香蕉泥，香蕉泥濃度分別為0、50、100、150、200 g/L。將滅菌的鐵皮石斛莖段分別接種在含不同濃度香蕉泥的培養基上，每種接種12 瓶，每瓶接種3~4 個外植體，3 次重復，培養溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統計腋芽誘導率，比較5 種培養基對鐵皮石斛腋芽誘導的影響，篩選出適合鐵皮石斛腋芽誘導的香蕉泥濃度。

1.2.4 鐵皮石斛芽增殖培養 將誘導出的腋芽切下，轉接到添加有不同濃度6-BA 和NAA 的培養基上（表2），每處理接種12 瓶，每瓶接種3~4 個腋芽，3次重復，培養溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統計腋芽增殖系數及叢生芽的生長情況，篩選出芽增殖最佳培養基。增殖系數計算公式如下。

表2 鐵皮石斛芽增殖培養基生長調節劑組合（單位：mg/L）

1.2.5 鐵皮石斛組培苗移栽馴化 當鐵皮石斛組培苗達4 cm 以上，且有6~8 片葉和3~4 條3 cm 以上的根時，取出組培苗并將組培苗根上的培養基清洗干凈，晾至根發白，然后移栽到裝有不同基質的花盆中，移栽的基質體積配比如表3 所示。每盆移栽3~4株幼苗，每種基質移栽10 盆，培養溫度（25±2）℃，30 d 后，統計莖的平均生長量及新增的芽數。計算公式如下。

表3 鐵皮石斛幼苗移栽馴化基質組合（單位：份）

2 結果與分析

2.1 不同生長調節劑組合對腋芽誘導的影響

不同生長調節劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導的影響見表4。從表4 可以看出，以MS 為基本培養基，不同生長調節劑組合對鐵皮石斛腋芽的誘導有明顯的差異。其中2 號培養基的腋芽誘導率最高，為76.5%，腋芽飽滿、濃綠、健壯，6 號培養基的腋芽誘導率為71.4%，腋芽葉色濃綠、較為粗壯。其他幾種培養基的腋芽誘導率較低，且有部分外植體的腋芽較瘦弱、顏色發黃、生長速度緩慢，有少量腋芽在后期褐化死去。綜合來看，2、6 號培養基均適合鐵皮石斛腋芽的誘導。

表4 不同生長調節劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導的影響

2.2 不同濃度香蕉泥對腋芽誘導的影響

通過對加入不同濃度香蕉泥的培養基比較發現，培養基中加入香蕉泥比不加入香蕉泥的腋芽誘導率要高（表5），其中培養基中加入100 g/L或150 g/L香蕉泥的鐵皮石斛腋芽的長勢好、新芽健壯、芽葉濃綠，腋芽基部有少數根生成。試驗中，隨著香蕉泥的濃度增大，鐵皮石斛的腋芽誘導率增加，香蕉泥的濃度達到200 g/L 時，腋芽的誘導率不再增加，更高濃度的香蕉泥對腋芽誘導率的增加沒有效果。考慮經濟成本，選擇培養基中加入100 g/L 的香蕉泥。綜上所述，最適合鐵皮石斛腋芽誘導的培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L 香蕉泥。

表5 不同濃度香蕉泥對鐵皮石斛腋芽誘導的影響

2.3 不同生長調節劑組合對芽增殖的影響

將誘導出的鐵皮石斛腋芽切下接種在5 種增殖培養基上，10 d 后，發現切口處長出少量叢生芽，芽濃綠、健壯，部分芽基部出現數條細小的根（圖1a）。25 d 后，腋芽長高，芽上有6~7 片新葉，葉色濃綠（圖1b），60 d 后幼苗已長至10 cm 左右，基部分化出數條健壯的根（圖1c）。從表6 可以看出，1—3 號培養基中，NAA 濃度不變時，隨著6-BA 濃度增加鐵皮石斛增殖系數降低。4 號培養基的6-BA 和NAA 濃度都較高，其叢生芽的增殖率并不高，且叢生芽較瘦弱，可能是高濃度的生長調節劑抑制了叢生芽的生成，當6-BA 的濃度為2.0 mg/L、NAA 的濃度為0.5 mg/L 時，鐵皮石斛的增殖系數最高，長勢最好。鐵皮石斛芽增殖最適培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。6-BA 和NAA 的生長調節劑組合，不僅能用于鐵皮石斛腋芽、叢生芽的增殖，而且也有利于根的形成。

圖1 鐵皮石斛組培苗長勢

表6 不同生長調節劑組合對鐵皮石斛芽增殖的影響

2.4 不同移栽基質對鐵皮石斛組培苗移栽馴化的影響

當鐵皮石斛組培苗達到移栽要求時，將組培苗根上的培養基洗干凈，晾至根發白（圖2），再移栽到裝有不同基質的花盆中。從表7 可以看出，鐵皮石斛的5 種移栽基質，單一基質和復合基質的幼苗成活率均為100%。單一基質鋸末和混合基質松樹皮+鋸末（7∶3），平均有6 個新芽萌發，且新芽色濃綠、莖粗壯，老莖加粗較為明顯；而混合基質珍珠巖+松樹皮（1∶1）和鋸末+碎磚末（9∶1），都有5 個新芽萌發，新芽葉色綠、莖較壯，莖有伸長和加粗；單一基質松樹皮，只有2 個新芽萌發，莖生長較緩慢。從莖平均生長量分析，單一基質鋸末中的莖平均生長量為2.6 cm，是5 種栽培基質莖伸長最多的；混合基質松樹皮+鋸末（7∶3）的莖生長2.5 cm，這2 種移栽基質莖段生長明顯。混合基質珍珠巖+松樹皮（1∶1）和鋸末+碎磚塊（9∶1），雖然平均新發芽數較多，但其莖的伸長較小，因此，最適合鐵皮石斛組培苗移栽馴化的基質是單一基質鋸末和混合基質松樹皮+鋸末（7∶3）（表7、圖3）。

圖2 鐵皮石斛組培苗移栽前曬苗

圖3 鐵皮石斛組培苗移栽馴化

表7 不同栽培基質對鐵皮石斛組培苗移栽訓化的影響

3 小結與討論

鐵皮石斛腋芽的誘導和叢生芽的增殖與生長調節劑、天然添加物、培養基的基本成分等有關。植物生長調節劑是植物組織培養不可或缺的物質，用量雖少但在植物組織培養過程中非常重要，而合適的生長調節劑組合又是成功培養鐵皮石斛的關鍵。馬玉申等［18］在鐵皮石斛帶節莖段的組培快繁體系研究中發現，當6-BA 為2.0 mg/L、NAA 0.2~0.6 mg/L 誘導效果均較好，其中NAA 為0.2 mg/L 時效果最好。羅煥明等［19］認為，在鐵皮石斛組織培養中，香蕉泥的作用是使組培苗根系發達苗粗壯且整齊。本試驗結果表明，在鐵皮石斛腋芽誘導中，當6-BA 濃度為1.0 mg/L，NAA 濃度為0.5 mg/L 時效果最好。100 g/L的香蕉泥有助于鐵皮石斛的腋芽生長健壯，可使組培苗整齊、根系發達、葉色濃綠。在鐵皮石斛叢生芽增殖培養中，當6-BA、NAA 的濃度分別為2.0、0.5 mg/L 時，鐵皮石斛芽的增殖率最高，叢生芽數最多，長勢最好，增殖的新芽最健壯。潘梅等［13］認為在2.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA 的培養基上鐵皮石斛芽增殖效果最好。鐵皮石斛移栽馴化結果表明，鐵皮石斛在單一基質鋸末和復配基質松樹皮+鋸末（7∶3）中移栽后生長狀況好，新發枝條多，更有利于鐵皮石斛的工廠化生產。