五種殺菌劑在水稻上的吸收與傳導性能研究

張碩佳, 王超杰, 徐 博, 冉剛超, 曹立冬,曹 沖, 黃啟良, 朱 峰, 趙鵬躍*,

(1. 中國農業科學院 植物保護研究所，北京 100193；2. 河南省藥肥緩控釋工程技術中心，河南好年景生物發展有限公司，鄭州 450000；3. 貴州省農業科學院 植物保護研究所，貴陽 550006)

0 引言

水稻病害是影響水稻健康生長和豐產豐收的重要因素之一[1]。目前，國際上普遍采用莖葉噴施化學農藥的方法防治水稻病害[2]，但莖葉噴霧的防治效果會受到植株高度、冠層結構、有害生物在葉片的正面或背面的分布以及光照、溫度、濕度及風速等氣象因子的影響。農藥對靶劑量傳遞過程中存在著藥液蒸發飄移、彈跳破裂、因過度鋪展而脫靶流失等缺陷，導致農藥利用率低；同時，農藥會飄移到非靶標生物上，對非靶標生物造成危害[3]。根部施藥技術是一種根據防治對象發生與為害位置，將選定劑量的農藥通過撒施、種子處理、土壤處理等處理方式施用在作物根部，利用作物的蒸騰拉力把根部的農藥吸收并轉運到靶標部位的技術措施[4-5]。相比于莖葉噴霧施藥，根部施藥避免了藥液飄移、彈跳、流失等缺陷，減小了對非靶標生物的危害，也避免了藥劑受到外界環境的影響而分解。通過農藥制劑加工技術，以農藥有效成分為芯材，利用天然或人工材料將有效成分包裹加工成微囊、顆粒劑及種衣劑等劑型，通過根部施藥的方式，可避免農藥受光照、溫度等外界環境的影響而分解，從而延長了農藥持效期[6]。

農藥種類的選擇對于通過根部施藥防治植物地上病害十分重要，選擇能夠被植物根部吸收并易向上傳導的農藥可提高防治效果[7]。農藥被作物吸收轉運的程度取決于其油水分配系數 (logKow)、水溶性 (Sw)、解離常數 (pKa)、農藥分子質量、土壤有機質含量和外部水相的pH 值等眾多因素[8-13]。通過這些因素的理論值可以快速判定農藥的內吸性，但是實際生產中，每種農藥在不同場景和不同植物中的吸收轉運情況有所不同，選用哪種農藥進行根部施藥需要通過實際應用來論證[14]。

按照農藥在植物體內的吸收傳導性能，可將其分為內吸性和非內吸性兩類。內吸性農藥可被植物體吸收，從施藥部位滲入到植物體內并向其他部位移動，最終達到防治病蟲害的目的，該類農藥受雨量、氣候等環境因素的影響小[15]；而非內吸性農藥施用于種子、莖、葉片或果實上，由于大部分有效成分存留于植物體外表面，小部分有效成分雖能滲透進內表皮但不會遠距離移動，使得有效成分易于脫離靶標部位，對于已受病蟲害侵染的植物組織或植物的新生組織保護效果低[16]。然而，各類農藥均會在植物體上表現出不同程度的滲透和擴散作用，幾乎沒有絕對的非內吸性農藥，只是因植物種類、吸收部位、植物生長時期的不同而表現出較大的差異[17-18]。在農藥制劑加工過程中，助劑的添加和使用可調節農藥在靶標作物上的滲透性，從而改善農藥的吸收和傳導性能。三環唑、己唑醇、嘧菌酯、氟環唑和噻呋酰胺是常用于防治水稻病害的5 種不同類型的殺菌劑，其中三環唑抑制附著孢黑色素的形成，從而抑制孢子萌發和附著孢形成[19]；己唑醇和氟環唑可破壞和阻止病菌的細胞膜重要組成成分麥角甾醇的生物合成，導致細胞膜不能形成，使病菌死亡[20]；嘧菌酯能夠抑制病原菌呼吸產能過程而使孢子萌發和菌絲侵染受到抑制[21-22]；噻呋酰胺可抑制病原菌三羧酸循環中的琥珀酸去氫酶的活性，最終導致菌體死亡[23]。本研究通過構建室內水稻生長模型，研究根部施藥后上述5 種殺菌劑在水稻幼苗根部和莖葉部的分布規律，明確在根部施用過程中影響植物對農藥吸收及傳輸的重要因素，旨在為篩選適合水稻根部施用的藥劑提供技術指導，為高效防治水稻病害提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料與儀器

96%三環唑 (tricyclazole) 原藥、96%噻呋酰胺 (thifluzamide) 原藥、96%己唑醇 (hexaconazole)原藥、95%氟環唑 (epoxiconazole) 原藥和98%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原藥，分別購自江蘇長青農化股份有限公司、海利爾藥業集團公司、江蘇常隆農化有限公司、浙江禾本科技有限公司和江蘇連云港立本農藥化工有限公司。Dispersogen LFS，諾農 (北京) 國際生物技術有限公司；ATLOX4919-LQ-(AP)，禾大化學品 (上海) 有限公司；SP-SC29和SP-27001，江蘇擎宇化工科技有限公司；農乳602 號，邢臺市燕誠化學助劑有限公司；BY-140，滄州鴻源農化有限公司；丙二醇 (分析純) 和乙二醇 (分析純)，國藥集團化學有限公司；硅酸鎂鋁，蘇州國建慧投礦物新材料有限公司；消泡劑622，中農立華 (天津) 農用化學品有限公司；有機硅消泡劑和4%黃原膠，上海源葉生物科技有限公司；多聚甲醛，上海吉至生化科技有限公司；色譜級乙腈，默克公司 (德國)；N-丙基乙二胺(PSA)，安捷倫科技有限公司 (中國)；石墨化碳黑(GCB)，天津博納艾杰爾科技有限公司；無水硫酸鎂，上海麥克林生化科技有限公司；氧化鋯珠(1.0～1.2 mm)，北京中科捷瑞生物科技有限公司。

營養土，黑龍江五常楊曉東育苗基質加工廠。水稻種子：M163，中國農業科學院植物保護研究所提供。

高效液相色譜-串聯質譜儀 (SCIEX-5 500)、數顯型頂置式機械攪拌器和高性能分散機 (T25 digital ULTRA-TURRAX?) 分別購自美國AB SCIEX 公司和德國 IKA 公司。

1.2 供試殺菌劑懸浮劑的制備

由于三環唑、己唑醇、嘧菌酯、氟環唑和噻呋酰胺常見的劑型為懸浮劑，且易于制備，對操作者和環境安全性好，故本研究中將5 種殺菌劑均加工成懸浮劑用于室內試驗，配方見表1。

表1 5 種殺菌劑懸浮劑制備配方Table 1 Formulations of five fungicides SC

每種懸浮劑按照水、助劑 (黃原膠除外)、原藥、水、鋯珠 (m(物料量) :m(鋯珠量) =1.0 : 1.2)的順序添加至容器中，使用轉速為1 900 r/min 的機械攪拌器砂磨1.5 h 后，過濾去除鋯珠，按照黃原膠的質量比向回收的制劑里添加黃原膠，再使用高性能分散機剪切10 min，轉速為6 000 r/min。最終制得40%三環唑懸浮劑(D90：6.630 μm)、24%噻呋酰胺懸浮劑(D90：7.153 μm)、30%己唑醇懸浮劑(D90：1.795 μm)、25% 氟環唑懸浮劑(D90：2.704 μm)和25%嘧菌酯懸浮劑(D90：1.632 μm)。

1.3 水稻幼苗處理

根據預試驗得到的水稻幼苗可承受的各殺菌劑的最大劑量，參考“中國農藥信息網”登記中5 種殺菌劑防治水稻病害的推薦劑量[24]，最終確定在營養液培育條件下水稻幼苗的施藥濃度為：每千克水三環唑100 mg、噻呋酰胺30 mg、氟環唑30 mg、己唑醇20 mg 和嘧菌酯60 mg；在營養土培育條件下水稻幼苗的施藥濃度為：每千克土壤三環唑400 mg、噻呋酰胺120 mg、氟環唑120 mg、己唑醇80 mg 和嘧菌酯240 mg。按照上述濃度對水稻幼苗進行施藥處理。

待種子萌發后，將水稻幼苗分別移植到水稻營養液和營養土中栽培，進行土培試驗和水培試驗。當幼苗生長至三葉一心期時，按照上述施藥濃度分別對水稻幼苗進行根部施藥處理，其中營養液條件下，先將農藥懸浮劑稀釋于營養液中達到相應的濃度，然后將水稻移栽于營養液中；在營養土條件下，先將對應劑量的懸浮劑稀釋于少量水中，然后澆灌于根部附近的土壤中。分別于施藥處理后4 h 和1、2、3、5、7、10、14 d 采集水稻樣品。對于水培樣品，采樣期間及時補充試驗中被蒸發和吸收的水分，使水稻幼苗在采樣期間保持在相同環境條件下生長。

1.4 殺菌劑在水稻幼苗中的分布試驗

先用大量水沖洗水稻樣品根部表面的殺菌劑，再把莖葉部和根部分離并分別勻漿，裝入封口袋中稱重，于 -20 ℃冰箱儲存，待測。

均參照QuEChERS 方法對樣品進行提取[25]。稱取樣品 (莖葉部1.0 g，根部0.5 g，精確到0.01 g)于離心管中，加入超純水 (莖葉部3 mL，根部1 mL)，靜置5 min 后加入5 mL 乙腈，渦旋振蕩5 min 后加入3 g 氯化鈉，繼續渦旋振蕩5 min，以4 000 r/min 的轉速離心5 min。取上清液1 mL 于裝有凈化劑的2 mL 離心管中 (莖葉部凈化劑為50 mg PSA、10 mg GCB 和150 mg 無水硫酸鎂，根部凈化劑為50 mg PSA 和150 mg 無水硫酸鎂)，渦旋振蕩1 min 后，以4 000 r/min 的轉速離心5 min，取上清液過0.22 μm 有機濾膜，用乙腈稀釋至基質標準曲線濃度范圍內，待測。

分析方法驗證：分別配制0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 和2 mg/L 的三環唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟環唑和嘧菌酯在水稻莖葉部和根部基質中的標準溶液，在對應的儀器條件下，繪制5 種殺菌劑的線性回歸方程。根據實測質量濃度，對水稻莖葉部及根部樣品進行3 個不同水平的添加回收試驗，并稀釋至基質標準曲線濃度范圍內進樣分析。每個試驗重復5 次。

1.5 水稻幼苗中殺菌劑的檢測分析方法

利用高效液相色譜-串聯質譜儀 (HPLC-MS/MS) 測定水稻樣品中的供試殺菌劑含量。使用Hypersil GOLD C18(50 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美國賽默飛公司) 色譜柱分離目標物。柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5.0 μL；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，5 種殺菌劑的洗脫程序如下：

三環唑：0～1.0 min，95% A + 5% B～40% A +60% B；＞1.0～4.0 min，40% A + 60% B；＞4.0～4.5 min，40% A + 60% B～95% A + 5% B；＞4.5～6.0 min，95% A +5% B。保留時間為2.29 min。

噻呋酰胺：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A +80% B；＞1.0～4.5 min，20% A + 80% B；＞4.5～5.0 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；＞5.0～7.0 min，80% A + 20% B。保留時間為2.51 min。

己唑醇：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A+ 80% B；＞1.0～5.0 min，20% A + 80% B；＞5.0～5.5 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；＞5.5～8.0 min，80% A + 20% B。保留時間為2.96 min。

氟環唑采用等度洗脫：0～5.0 min，50% A +50% B。保留時間為2.79 min。

嘧菌酯：0～1.0 min，80% A + 20% B～20% A +80% B；＞1.0～5.0 min，20% A + 80% B；＞5.0～5.5 min，20% A + 80% B～80% A + 20% B；＞5.5～8.0 min，80% A + 20% B。保留時間為2.80 min。

質譜掃描模式為選擇性多反應監測模式 (MRM)。正離子模式下：霧化氣溫度500 ℃，輸入電壓10 V，輸出電壓10 V，輔助氣壓力379.2 kPa，鞘氣壓力379.2 kPa，噴霧電壓500 V；負離子模式下：霧化氣溫度500 ℃，輸入電壓 -10 V，輸出電壓 -18 V，輔助氣壓力379.2 kPa，鞘氣壓力379.2 kPa，噴霧電壓 -4 500 V。其他質譜參數見表2。5 種殺菌劑標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 殺菌劑標準溶液的總離子流圖Fig. 1 Total ion flow diagrams of fungicide standard solutions

表2 5 種殺菌劑的質譜參數Table 2 Mass spectrum parameters of five fungicides

1.6 轉運因子計算

轉運因子 (translocation factor，簡稱TF) 常用來評價化合物在作物中向上傳導能力，通過計算5 種殺菌劑在水稻中的TF 值可評估其在水稻植株中的傳導能力。計算公式為TF=Ca/Cr[26]，其中Ca和Cr分別為化合物在植物莖葉和根中的含量。TF ＞ 1 表示該化合物易于由根部向上傳導。

2 結果和討論

2.1 分析方法的確證

5 種殺菌劑在水稻莖葉部和根部基質中的質量濃度與對應的響應值呈良好的線性關系，其線性方程決定系數 (R2) 均大于0.99 (表3)。

表3 5 種殺菌劑在水稻莖葉部和根部基質中的線性方程與決定系數Table 3 Linear equations and determination coefficients of five fungicides in stem, leaves and roots

添加回收試驗結果 (表4) 顯示，在不同添加水平下，5 種殺菌劑在水稻莖葉部及根部樣品中的平均回收率在82%～117%，相對標準偏差 (RSD)均小于10%，表明該方法符合分析要求。以信噪比為10 分別計算三環唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟環唑和嘧菌酯在不同基質中的定量限(LOQ)[27]，LOQ 范圍在0.001～0.010 mg/kg 之間。

表4 5種殺菌劑在水稻莖葉部和根部基質中的添加回收率、相對標準偏差 (RSD) 及定量限 (LOQ)Table 4 Recoveries, relative standard deviations (RSD), and limits of quantitation (LOQ) of five fungicides in rice aerial portions and roots

續表4Table 4 (Continued)

2.2 殺菌劑在營養土栽培水稻幼苗中的分布

在營養土栽培條件下， 用5 種殺菌劑分別處理水稻幼苗根部后，在4 h～14 d 內其含量如圖2所示，其中三環唑處理14 d 后的樣品未采集，噻呋酰胺處理1 d 后及氟環唑處理4 h 后水稻莖葉部殺菌劑的含量未檢出。

由圖2(a)可以看出：用三環唑處理后，水稻幼苗根部三環唑的含量在4 h～2 d 內明顯高于莖葉部；處理后3 d，其根部和莖葉部的含量分別為29.96 和28.37 mg/kg，且無顯著差異；處理5～10 d后，三環唑在莖葉部的含量明顯高于根部；三環唑在水稻幼苗莖葉部的含量呈現增加的趨勢，并在處理后10 d 到達最高值75.88 mg/kg，而在水稻幼苗根部中，三環唑含量保持在20.00～41.64 mg/kg范圍內。該結果表明，三環唑能夠被水稻幼苗根部吸收，并能夠迅速向上傳導到莖葉部位，具有良好的向上傳導性能。

圖2 營養土栽培條件下，根部施藥后水稻莖葉部和根部中的殺菌劑含量Fig. 2 Fungicide dose distributions in rice aerial portions and roots after root application under soil cultivation

在用噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟環唑進行根部處理4 h～14 d 內，水稻幼苗根部的殺菌劑含量遠遠高于莖葉部位 (圖2 (b～e))。例如，在全部采樣期間內，己唑醇在幼苗根部的含量保持在4.51～5.52 mg/kg 范圍內，無明顯變化；而幼苗莖葉部的己唑醇含量僅為0.37～0.83 mg/kg。用嘧菌酯、噻呋酰胺和氟環唑處理后4 h～2 d 內，幼苗根部的含量保持增加的趨勢，3 d 后趨于穩定。用噻呋酰胺和嘧菌酯處理后，幼苗莖葉部殺菌劑含量在10 d 前呈現增加趨勢，14 d 后有所下降；而己唑醇處理后，幼苗莖葉部的殺菌劑含量在5 d 前呈現增加趨勢，7 d 后呈現下降趨勢。由于水稻的生長稀釋及植物對殺菌劑的代謝作用，雖然水稻根部能夠不斷吸收殺菌劑，但部分殺菌劑在幼苗相同部位的含量出現隨采樣時間延長而下降的現象。該結果表明，噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟環唑雖然能夠被水稻幼苗根部吸收，少部分殺菌劑可向上傳導到莖葉中，而大部分仍在根部分布，向上傳導性能較差。

2.3 殺菌劑在營養液培養水稻幼苗中的分布

在營養液培養條件下，用5 種殺菌劑懸浮劑分別處理水稻幼苗根部，在處理后4 h～14 d 內各殺菌劑在水稻莖葉部和根部的含量如圖3 所示，其中三環唑于處理14 d 后的樣品未采集。

圖3 營養液培養條件下，根部施藥后水稻莖葉部和根部中的殺菌劑含量Fig. 3 Fungicide dose distributions in rice aerial portions and roots after root application under nutrient solution cultivation

由圖3(a)可以看出：用三環唑處理后，水稻幼苗根部三環唑的含量在4 h～2 d 內明顯高于莖葉部；處理后3 d，其在根部和莖葉部的含量分別為351.31 和345.53 mg/kg，且無顯著差異；處理5～10 d 后，其在莖葉部的含量明顯高于根部；三環唑在水稻幼苗莖葉部的含量在處理5 d 后呈下降趨勢，而在根部中劑量保持在253.08～351.31 mg/kg 范圍內。該結果表明，三環唑先被水稻幼苗根部快速吸收并達到一定濃度，然后向上傳導到莖葉部位，與營養土培養的結果類似。

除三環唑外，其他4 種殺菌劑在水稻幼苗莖葉部的含量在4 h～14 d 中均呈現上升趨勢 (圖3(b～e))。處理后14 d，己唑醇和氟環唑在莖葉部的含量與根部無明顯差異，而噻呋酰胺和嘧菌酯在整個采樣時期莖葉部的含量均低于根部。與營養土培養結果相比，噻呋酰胺、己唑醇、嘧菌酯和氟環唑也能夠被水稻幼苗根部吸收并向上傳導，其中水稻幼苗在營養液中對己唑醇和氟環唑向上傳導的效果更好。在營養液培養條件下，噻呋酰胺和嘧菌酯大部分仍分布在根部，向上傳導性能較差，該結果與營養土培養類似。

2.4 5 種殺菌劑在水稻上的吸收傳導性能

根據在水稻莖葉部和根部樣品中檢測出的5 種殺菌劑的含量，分別計算營養土和營養液培養模式下水稻對5 種殺菌劑的TF 值，結果見表5。在營養土培養模式下，三環唑處理后4 h～10 d，TF 值一直保持增長的趨勢，10 d 時達到最高值(1.93)；在營養液培養模式下，三環唑TF 值呈現先增長后穩定的趨勢，3 d 達到0.98，5 d 后TF 值均大于1，表明三環唑在植物中具有良好的向上傳導性能。在營養液培養模式下，氟環唑和己唑醇TF 值也保持一直增長的趨勢，14 d 時TF 值達到1 或以上；而在營養土培養模式下，己唑醇和氟環唑TF 值較低，可能是受到土壤對已唑醇和氟環唑的吸附作用影響。在兩種培養模式下，噻呋酰胺和嘧菌酯的TF 值均小于1，均呈現先增加后降低的趨勢，表明噻呋酰胺和嘧菌酯在水稻幼苗體內的向上傳導性能較差。

表5 5 種殺菌劑在水稻上的轉運因子TF 值Table 5 TF values of five pesticides in rice

在預試驗中，分別研究了水稻幼苗可承受的各殺菌劑的最大濃度，并以此作為施藥濃度。由于不同殺菌劑對水稻生長的影響不同，最終5 種殺菌劑對水稻幼苗根部施藥的濃度有一定差異。本文研究在水稻幼苗最大承受濃度下不同殺菌劑在水稻上的吸收傳導性能。另外，在農藥制劑加工過程中，助劑的加入可改善農藥在靶標作物上的滲透性。本研究中，5 種懸浮劑制備時使用的助劑均為常規產品，雖然部分助劑添加量有少許不同 (如表1 所示)，但對其有效成分滲透性的影響較小。

3 結論

本研究建立了水稻幼苗莖葉部和根部中三環唑、噻呋酰胺、己唑醇、氟環唑和嘧菌酯5 種殺菌劑的QuEChERS 樣品前處理方法和HPLCMS/MS 檢測方法，該方法操作簡便，靈敏度和準確性均符合農藥分析檢測要求。利用該方法研究了在營養土和營養液培養條件下5 種殺菌劑在水稻幼苗中的吸收傳導行為。結果表明，5 種殺菌劑均可被水稻幼苗根部吸收并向上傳導，但吸收傳導性能受到殺菌劑本身性質等因素影響，其中三環唑在營養土和營養液培育試驗中，相對于100 mg/kg 的營養液施藥濃度和400 mg/kg 的營養土施藥濃度，水稻莖葉部的含量在營養土培育中最高可達到75.88 mg/kg，在營養液培育中可達到655.84 mg/kg，表明三環唑在水稻中表現出良好的吸收和向上傳導性能，而水稻幼苗對于其他4 種殺菌劑的吸收傳導性能較差；5 種殺菌劑在營養土和營養液兩種不同的培育條件中吸收傳導性能差異較大，表明了土壤對殺菌劑的吸附會影響植物對殺菌劑的吸收及傳導。因此，與其他4 種殺菌劑相比，三環唑更加適合水稻根部施藥，更易于通過根部吸收后向上傳導，并抵御植物病害的侵染。結合不同種類殺菌劑的防治對象，在水稻苗期根部施用三環唑可有效預防稻瘟病的發生。

然而，目前三環唑在水稻上常用的施藥方式是莖葉噴霧，根部施藥的應用較少。作為一種保護性殺菌劑，三環唑需要在病害潛伏期施用以減少其對植物的侵染。若提前進行莖葉噴霧會導致殺菌劑因受到光照、空氣、水和微生物的影響而分解，還存在藥液飄移、彈跳、流失等問題。相比莖葉噴霧方式，根部施藥能夠避免噴霧過程中藥液流失的問題，而且不受雨量、風速等環境因素的影響，從而可有效提高農藥利用率。目前，根部施藥的劑型以顆粒劑為主，可按規定藥量通過撒施的方式施藥。在顆粒劑研發過程中，可先通過對農藥內吸傳導性能的篩選，選擇合適的農藥有效成分進行研發并登記使用，該方法是一種可以提高農藥利用率且對環境友好的技術手段，對于農藥安全使用具有重要意義。