深綠木霉T2 菌株發酵液蛋白提取物TraT2A 抑菌條件優化及其對百合葉斑病的田間防治效果

陳應娥, 梁巧蘭, 魏列新, 同發宇, 王 冬

(甘肅農業大學 植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

木霉菌是半知菌亞門絲孢綱絲孢目的一類腐生真菌，廣泛存在于土壤、根圍、葉圍及種子和球莖中等，也是重要的生防菌[1-4]。據報道，木霉菌對多種病原菌如尖鐮孢菌Fusarium oxysporum、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、百合疫霉菌Phytophthora cactorum和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea等均具有生防拮抗作用[5-6]。研究表明，生防木霉菌株或其發酵液、發酵液蛋白提取物均能提高植物體內與抗病性相關的酶活性，誘導植物產生抗病性，促進植物生長[7-9]，其中TraT2A 是通過對深綠木霉T2 菌株 (Trichoderma atrovirideT2 strain) 發酵液進行離心過濾、鹽析、透析、Sephadex G-100 凝膠、柱層析獲得的具有激發子活性的蛋白質，可提高植物與抗病性相關的防御酶活性，增加葉片中葉綠素和蠟質含量，降低丙二醛含量，并促進胼胝質的積累，誘導蘭州百合對灰霉病產生抗性，減輕該病害的發生[10-13]。

目前，針對百合病害防治主要依賴化學藥劑，而化學藥劑在使用時由于植物自身或自然環境等因素影響，藥效并不能完全發揮，且存在農藥殘留、污染嚴重等問題[14-15]，篩選生物藥劑已成為發展百合產業、提高百合品質的有效舉措。據報道，大蒜鱗莖粗提液、紫莖澤蘭提取液及其與沼液混合液等植物源農藥[16-17]，放線菌發酵液[18]及申嗪霉素、中生菌素等抗生素類殺菌劑均可有效防治尖孢鐮孢菌引起的百合枯萎病。但是，生物農藥易受紫外線等環境因素影響，防效發揮不穩定且作用緩慢，影響其在生產實際中的應用。針對此問題，在生物農藥研發中通過添加性能更高的農藥助劑如紫外保護劑、輔助劑等可改善藥劑的理化性能，增加植物對農藥有效成分吸收利用率，提高防病效果。研究發現，40 mg/mL TraT2A對蘭州百合灰霉病菌抑制率為28.60%，誘導抗病效果大于50%[11,13]，但其受紫外光等環境因素影響較大，在自然條件下穩定性較差，誘導抗病作用的持效期較短。因此，在以TraT2A 為有效成分的生防菌劑研制中篩選添加紫外保護劑和提高有效成分吸收利用率的輔助劑是增加其穩定性、提高其田間使用效果的關鍵，為此，本研究采用菌絲生長速率法測定了不同濃度下TraT2A 對百合葉斑病菌的抑制作用，對2 種紫外保護劑及3 種能提高植物對TraT2A 吸收利用率的輔助劑進行了優化和篩選，并進行了田間防效試驗，旨在為開發對百合葉斑病防治效果較高的TraT2A 制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：百合葉斑病菌Alternaria alternata，由甘肅農業大學植物保護學院農藥學實驗室提供。

藥劑：深綠木霉T2 菌株發酵液蛋白提取物(TraT2A)，由甘肅農業大學植物保護學院農藥學實驗室發酵提取 (TraT2A 在595 nm 處的OD 值為3.26，產量為800 mL/4 L)[12]；輔助劑SP-4821A、SP-4821B 和IE-08 均為改性脂質體，一種源自大豆磷脂的輔助劑[19]，由江蘇擎宇化工科技有限公司提供；99%抗壞血酸購自天津市凱信化學工業有限公司；90%腐殖酸購自湖北省宜都市華明化工有限公司。

儀器設備：UV-9000S 紫外分光光度計 (上海元析儀器有限公司)；LDZF-75L-11 高壓蒸汽滅菌器 (上海申安)；HPX-II-300 生化培養箱 (上海躍進醫療器械有限公司)；SQP 電子天平 (賽多利斯科學儀器有限公司)；HCB-1300V 超凈工作臺 (青島海爾生物醫療有限公司)；HNY-211B 全溫度振蕩培養箱 (天津歐諾儀器股份有限公司)；Axio Lab.A1生物顯微鏡 (Carl Zeiss)。

供試百合品種為蘭州百合Lilium davidiiDuch，由蘭州市七里河區百合種植基地提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉14 g，蒸餾水加至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 TraT2A 抑菌活性測定 采用菌絲生長速率法[20]：將滅菌的40.00、45.00 和46.67 mL PDA 培養基冷卻至45 ℃左右時，分別加入10.00、5.00 和3.33 mL TraT2A，混勻，每個處理分別倒入3 個滅菌培養皿中，制成平板，使TraT2A 在培養基中的質量濃度分別為200.00、100.00 和66.67 mg/mL，以同樣的方法加入無菌水作為空白對照；用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌絲朝下接入PDA 平板中央，每個處理重復3 次，置于25 ℃下恒溫培養，于4 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算抑制率 (I)。

式中：DCK為空白對照菌落平均直徑，mm；DPT為處理菌落平均直徑，mm。

1.2.2 TraT2A 抑菌條件的優化

1.2.2.1 紫外光照射時間對TraT2A 抑菌活性的影響 取200.00 mg/mL 的TraT2A 分別在紫外光下(波長為280 nm，強度為100 μw/cm2，預熱30 min，保證光源穩定性) 照射10、20、30 和40 min，備用；將滅菌的40 mL PDA 培養基冷卻至45 ℃左右時，分別加入10 mL 上述經紫外光照射不同時間的TraT2A，混勻，制成平板，以加入不經過紫外光照射的TraT2A 和無菌水分別作為TraT2A 對照和空白對照，每個處理重復3 次，置于25 ℃下恒溫培養，于4 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算抑制率，分析不同紫外光照射時間對TraT2A 抑菌活性的影響。

1.2.2.2 紫外保護劑對TraT2A 抑菌活性的影響

將紫外保護劑抗壞血酸、腐殖酸250 mg 分別加入到10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A 中，在紫外光下 (波長為280 nm，強度為100 μw/cm2，預熱30 min，保證光源穩定性) 照射30 min，備用；將滅菌的39.75 mL PDA 培養基冷卻至45 ℃左右時，分別加入10 mL 上述經過紫外光照射30 min 包含有抗壞血酸、腐殖酸的TraT2A，混勻，以加入未經紫外光照射的TraT2A、經過紫外光照射30 min 的TraT2A 以及無菌水分別作為TraT2A對照、紫外光照射的TraT2A 對照和空白對照，每個處理重復3 次，置于25 ℃下恒溫培養，于4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算抑制率，分析不同的紫外保護劑的抑菌活性及其對TraT2A抑菌活性的影響。

1.2.3 輔助劑對TraT2A 抑菌活性的影響 用滅菌水分別溶解輔助劑IE-08、SP-4821A 和SP-4821B，使輔助劑IE-08 的質量濃度為0.50、0.25、0.13、0.07 和0.04 mg/mL；SP-4821A 和SP-4821B 的質量濃度為0.17、0.09、0.05、0.03 和0.02 mg/mL。分別取1 mL 輔助劑和10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A，同時加入到滅菌冷卻至45 ℃的39 mL PDA 培養基中，混勻，每個處理倒入3 個滅菌培養皿中，制成含藥培養基。以向40 mL PDA 中加入10 mL 200.00 mg/mL 的TraT2A 和10 mL 無菌水分別作為TraT2A 對照和空白對照，向39 mL PDA 中加入1 mL 輔助劑和10 mL 無菌水的 PDA培養基作為輔助劑對照，每個處理重復3 次，置于25 ℃下恒溫培養，于4 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算抑制率，分析不同濃度的輔助劑的抑菌活性及其對TraT2A 抑菌活性的影響。

1.2.4 TraT2A 與輔助劑混合液對百合葉斑病的田間防效 在甘肅農業大學試驗田開展田間藥效試驗，試驗地為壤土，土地平整，土壤肥力一致。將蘭州百合種球種植于試驗田中，每隔5 d 澆水1 次，定期除草，確保百合幼苗正常生長，備用；向培養7 d 的交鏈格孢菌PDA 平板中加入10 mL滅菌水，用接種環在培養基表面輕輕摩擦，使孢子懸浮于滅菌水中，然后用雙層紗布過濾，濾液于1 000 r/min 下離心5 min，棄去上清液，沉淀用滅菌水洗滌3 次，用血球計數板鏡檢計算孢子濃度，并用滅菌水將孢子懸浮液稀釋至濃度為1 ×107個/mL；接種前4 d 向田間灌足水，接種當日于6：00 將交鏈格孢分生孢子懸浮液以噴霧方式接種于田間生長健壯的、苗齡60 d 的百合幼苗上，噴霧量以葉面完全濕潤為宜；然后把報紙制成直徑30 cm、高60 cm 的圓柱筒，套在百合幼苗上，并在其上套上保鮮袋，用于接種苗的遮陽保濕，以確保病原菌孢子萌發和侵染發病，共接種處理150 株，劃分為15 個小區，每小區10 株；根據預試驗結果，稱取200 g TraT2A，置于1 000 mL燒杯中，加入5 g 紫外保護劑腐殖酸和0.17 g 輔助劑SP-4821A，用滅菌水定容至1 000 mL，混勻，制成TraT2A 混合液，使混合液中TraT2A、腐殖酸和SP-4821A 的質量濃度分別為200.00、5.00和0.17 mg/mL，將此混合液以600 mL/小區的藥液量，采用噴霧法對接種后7 d 的百合幼苗葉片均勻噴霧。以噴施200.00 mg/mL TraT2A、5.00 mg/mL腐殖酸、0.17 mg/mL SP-4821A 的接菌百合幼苗分別作為TraT2A 對照、紫外保護劑對照和輔助劑對照，以噴施無菌水的接菌百合幼苗作為空白對照。每處理1 個小區，每小區10 株，重復3 次，每隔10 d 重復噴霧處理1 次，連續處理3 次，于每次施藥后10 d 根據病害分級標準調查各處理的百合幼苗發病情況，按公式 (2) 和 (3) 計算病情指數 (DI) 和防治效果 (CE)。

分級標準[21]：0 級：葉片無病斑；1 級：病斑面積占整個葉面積20%以下；3 級：病斑面積占整個葉面積＞20%～30%；5 級：病斑面積占整個葉面積＞30%～40%；7 級：病斑面積占整個葉面積＞40%～50%；9 級：病斑面積占整個葉面積＞50%。

式中：Ni為各級病葉數；Gi為該藥害對應級數；NT為調查總葉數；DITA為處理區防治后病情指數；DITB為處理區防治前病情指數；DICA為對照區防治后病情指數；DICB為對照區防治前病情指數。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2010 整理和繪制圖表，統計分析運用SPSS 21.0 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 TraT2A 抑菌活性的測定

結果 (表1) 表明：不同濃度的TraT2A 對百合葉斑病原菌A. alternata均有不同程度的抑制作用，其中200.00 mg/mL 處理的抑菌作用最高，抑制率為72.12%，而66.67 mg/mL 處理的抑菌作用最差，抑制率為26.92%，兩者之間差異達極顯著水平 (P＜0.01)。

表1 TraT2A 對百合葉斑病菌的抑菌作用Table 1 The inhibition effect of TraT2A on A. alternata

2.2 TraT2A 抑菌條件的優化

2.2.1 紫外光照射時間對TraT2A 抑菌活性的影響

結果 (表2) 表明：隨著紫外光照射時間延長，TraT2A 的抑菌活性逐漸降低，與TraT2A 對照及空白對照間差異均達極顯著水平 (P＜0.01)。

表2 紫外光照射時間對TraT2A 抑菌活性的影響 (200.00 mg/mL)Table 2 The influence of UV irradiation time on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)

2.2.2 紫外保護劑對TraT2A 抑菌活性的影響 結果 (表3) 表明，同未加紫外保護劑照射30 min 的TraT2A 對照相比，兩種紫外保護劑對TraT2A 活性都有保護作用，其中添加腐殖酸對TraT2A 的保護作用最高，抑制率為69.01%，比空白對照提高39.64%，但均略低于未經紫外照射的TraT2A 對照的抑制率。

表3 紫外保護劑對TraT2A 抑菌活性的影響 (200.00 mg/mL)Table 3 The influence of UV protective agents on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)

2.3 輔助劑對TraT2A 抑菌活性的影響

不同輔助劑對TraT2A 抑制百合葉斑病菌菌絲生長的活性均有影響：同種輔助劑濃度越大，TraT2A活性越高，抑菌作用越強，其中以0.17 mg/mL SP-4821A 處理的抑菌活性最好 (表4)。

表4 輔助劑對TraT2A 抑菌活性的影響 (200.00 mg/mL)Table 4 The influence of adjuvants on the inhibition activity of TraT2A (200.00 mg/mL)

2.4 TraT2A 與輔助劑混合液對百合葉斑病的田間防效

田間藥效試驗結果 (表5) 表明：隨著防治次數增加，200.00 mg/mL TraT2A + 5.00 mg/mL 紫外保護劑腐殖酸 + 0.17 mg/mL 輔助劑SP-4821A 混合液對百合葉斑病的防治效果逐漸升高，并于第3 次施藥后10 d 時達到最大，為80.37%，與單用TraT2A (防效為63.47%) 相比提高16.90%，差異達極顯著水平 (P＜0.01)。

表5 TraT2A 與紫外保護劑、輔助劑混合液對百合葉斑病的田間防效Table 5 The field control efficacy of TraT2A + UV protective agents + adjuvants mixture for lily leaf spot

3 討論與結論

目前，國內生物農藥劑型由于起步較晚還存在許多困難亟待解決，包括助劑種類過少、劑型單一、制劑開發及加工水平較低、制劑穩定性較低等問題[22-24]。輔助劑作為一種促進劑，可以包裹和攜帶農藥有效成分在植物中進行跨膜轉運，與其他藥劑混配后可明顯改善藥劑的浸潤和黏著性能，延長藥液在靶標表面的持留時間，促進農藥有效成分的吸收和傳導，從而提高藥效[25-27]。研究發現，深綠木霉T2 發酵液蛋白提取物TraT2A在低濃度時可以誘導蘭州百合產生抗病性，誘導抗病效果可達55.89%，其防治百合灰霉病的持效期為7 d，并可提高百合葉片中相關防御酶的活性[28]；當50% TraT2A 水分散粒劑的質量濃度分別為40 和20 mg/mL 時，其對百合灰霉病菌的抑制率及誘導抗病效果最高分別為61.79%和65.77%[29]；20% TraT2A 誘導劑水劑在10 倍液時，對百合裂褶菌的誘導抗病效果為61.21%[30]。本研究發現，高濃度的TraT2A 對百合葉斑病菌具有較好的抑制作用，200.00 mg/mL 處理的抑制率為72.12%，將200 g TraT2A (質量濃度為200.00 mg/mL) + 5 g 腐殖酸 (質量濃度為5.00 mg/mL) + 0.17 g SP-4821A(質量濃度為0.17 mg/mL) + 794.83 mL 滅菌水的混合液，進行葉面噴施，可有效防治蘭州百合葉斑病，田間防效為80.37%，與單用TraT2A 相比，其防治效果提高16.90%，表明在TraT2A 中加入紫外保護劑、輔助劑后可明顯提高其活性和防治效果，這可能是因為紫外保護劑、輔助劑可減輕TraT2A 受紫外線等環境因素影響，減少了TraT2A降解，而輔助劑SP-4821A 作為全新結構的吸收傳導促進劑增強了制劑稀釋液在葉片表面的濕潤性，促進了葉片對藥劑的吸收，提高了TraT2A 進入植物體內的速度，從而提高藥效。本研究僅分析了紫外光照射時間和輔助劑對TraT2A抑制蘭州百合葉斑病菌活性及田間防治效果，而關于在TraT2A中添加紫外保護劑、輔助劑后制備的20% TraT2A制劑的質量標準、穩定性、貨架期、防病持效期和大田防病效果等問題尚未涉及，有待進一步研究。