有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥功能菌篩選及對(duì)設(shè)施番茄品質(zhì)、生理活性的影響

許俊鋒，楊 蓉，詹發(fā)強(qiáng)，侯 敏，包慧芳，王 寧，龍宣杞，張志東，崔衛(wèi)東

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830001； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】生物多樣性水平降低，會(huì)使得土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降[1-2]。施用新型綠色環(huán)保生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，加強(qiáng)水肥一體化施用管理，提高番茄果實(shí)品質(zhì)，增強(qiáng)果實(shí)生理活性，在新疆綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】長(zhǎng)期施肥易使土壤板結(jié)程度升高，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降[3]；單施微生物菌劑可優(yōu)化土壤有益微生物菌群結(jié)構(gòu)，有益于作物品質(zhì)提升，減少病害，但易缺乏植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)[4]。細(xì)菌肥料可提高油茶果實(shí)產(chǎn)量[5]；增加豆類植物的蛋白質(zhì)含量[6]；提升楊梅果實(shí)VC、糖酸比等[7]；微生物肥料可替代化肥提高蘋果品質(zhì)，改善土壤環(huán)境[8]。【本研究切入點(diǎn)】多酚氧化酶(PPO)在果蔬加工中扮演著重要角色，能引起果蔬的酶促褐變，果蔬劣變，是導(dǎo)致果蔬加工、貯運(yùn)困難的一個(gè)關(guān)鍵因素[9]。苯丙氨酸解氨酶活性可以作為果實(shí)抗逆境能力的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。抗壞血酸過氧化物酶在抗氧化防御系統(tǒng)中可以清除H2O2，降低植物體內(nèi)活性氧的含量，在甘蔗等植物應(yīng)對(duì)外界逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用，可以響應(yīng)高溫、干旱、病害等環(huán)境脅迫[11]。當(dāng)果實(shí)處于正常環(huán)境下，超氧化物歧化酶表達(dá)穩(wěn)定，當(dāng)處于高溫、低溫等外部不利環(huán)境條件時(shí)，超氧化物歧化酶含量升高，可減弱果實(shí)因機(jī)械損傷產(chǎn)生的影響，推遲果實(shí)衰老， 延長(zhǎng)貯藏期[12]。目前有關(guān)有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥功能菌篩選及對(duì)設(shè)施番茄品質(zhì)、生理活性的文獻(xiàn)較少。需研究功能性菌株與有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥在高滲環(huán)境下復(fù)配的問題。【擬解決關(guān)鍵性問題】篩選在高滲環(huán)境下穩(wěn)定性好、活性較高的功能菌，制備生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥并在設(shè)施番茄中試驗(yàn)，檢測(cè)番茄不同品質(zhì)指標(biāo)的變化，篩選最優(yōu)菌肥配比及其對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)、生理活性的影響，提高番茄果實(shí)抗逆能力和品質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)設(shè)施番茄種植水肥高效輕簡(jiǎn)化管理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

試驗(yàn)于2020年9～11月在新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣水西溝鎮(zhèn)南絲路北出天山有機(jī)食材餐廳1號(hào)大棚內(nèi)進(jìn)行，地理位置為43°49N，87°50E，屬典型的大陸性氣候。試驗(yàn)大棚長(zhǎng)60 m，寬6 m，壟長(zhǎng)5 m，壟寬0.4 m，行距1 m。供試大棚日平均氣溫為25℃，夜平均氣溫為12℃，采用水肥一體化系統(tǒng)供水供肥，時(shí)間間隔為1周1次。

供試菌株為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所現(xiàn)有6種具有顯著的功能芽孢桿菌。

1.1.2 菌株篩選

將已保藏菌株干粉活化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)20 h后備用。取一環(huán)活化菌種，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，32℃，120 r/min培養(yǎng)20 h。分別取5 mL種子液，接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中(接種量為5 % ,V/V)。置32℃搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min，定期采用稀釋平板法檢測(cè)生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥中活菌數(shù)。表1

表1 6種細(xì)菌種類及簡(jiǎn)稱

1.1.3 供試培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基( g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，水1 000 mL，瓊脂 15，pH 6.8～7.0，1×105Pa滅菌30 min；

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10 ，酵母提取物 5，NaCl 10，水1 000 mL，pH6.8～7.0，1×10P5a滅菌30 min；

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 2，酵母膏 0.5，玉米漿 7.5，KH2PO40.1，K2HPO40.1，MgSO4·7H20 0.05，水1 000 mL，pH 6.8～7.0，1×I05Pa滅菌30 min。

1.1.4 供試肥料

供試有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥(N=7.75 %、P2O5=17.59 %、K2O=26.02 %、總養(yǎng)分≥52 %)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水灌溉研究所提供。

1.1.5 供試番茄

采用番茄品種為桃態(tài)粉，由新疆膳源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.1.6 主要儀器

UV-1901型紫外可見分光光度計(jì)，杭州俊生科學(xué)器材有限公司；IMS-20型全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司；SPX-420BF-2型生化培養(yǎng)箱，上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司；搖床ZHWY-100D，上海智城儀器制造有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)7個(gè)處理，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，滴灌方式澆水。番茄株距0.4 m，每壟面積2 m2。設(shè)置為CK(常規(guī)肥料，300 kg/hm2)、T1(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2)、T2(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，7.5 L/hm2)、T3(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)、T4(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，22.5 L/hm2)、T5組(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，30 L/hm2)、T6(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，37.5 L/hm2)。在番茄2穗時(shí)期開始施用，日期分別為9月23日、10月2日、10月13日、10月27日。其中，生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥的施用方式為隨水施用，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)對(duì)照。于11月10日進(jìn)行采摘，每組隨機(jī)選取大小相近色澤一致的成熟番茄20個(gè)，采摘后在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

活菌數(shù)：平板劃線法[13]、稀釋平板涂布法[14]。

番茄果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)：可溶性糖含量采用蒽酮比色法[15]；pH采用雷磁pH計(jì)測(cè)定[16]；可滴定酸采用0.1 mol/L NaoH測(cè)定法測(cè)定[17]；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[18]；可溶性固形物采用折光法測(cè)定[19]；硬度采用硬度儀測(cè)定[20]；色差采用色差儀測(cè)定[21]；VC、番茄紅素采用試劑盒測(cè)定；天平稱單果質(zhì)量(精確至1 g)[18]；用游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)縱橫徑(精確至0. 01 mm)并記錄[22]。

番茄果實(shí)生理指標(biāo)：多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過Excel 2007整理后利用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用origin 2019分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株穩(wěn)定性檢測(cè)

研究表明，在進(jìn)入高滲環(huán)境后，微生物大量死亡，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但一定時(shí)間后，能逐漸適應(yīng)并有效在有機(jī)肥中穩(wěn)定存在。其中，貝萊斯芽孢桿菌LYT-5能較快適應(yīng)有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥中高滲環(huán)境，穩(wěn)定存在于有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥中。表2

表2 不同菌株芽孢在有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥中穩(wěn)定表現(xiàn)

2.2 不同處理對(duì)番茄果實(shí)外觀品質(zhì)的影響

研究表明，不同處理均能夠促進(jìn)植株養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)果實(shí)膨大，施肥后番茄單果平均質(zhì)量均呈上升趨勢(shì)，且T4處理后番茄單果均重最大；單果平均質(zhì)量依次為T4>T5>T3>T6>T2>CK>T1；各處理果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑相較CK均有所提高，但處理組T3、T4、T5變化比較顯著，說明此處理菌液濃度能有效促進(jìn)番茄植株的養(yǎng)分吸收與轉(zhuǎn)化，濃度適宜番茄生長(zhǎng)需求；果形指數(shù)從CK組開始，呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，不同處理均能不同程度的促使番茄果形更加美觀。

T5處理后番茄果實(shí)硬度表現(xiàn)最好，較CK提高了4 %，硬度大小依次為T5>T2>T4>CK>T6>T3>T1；適宜菌液濃度能夠使番茄硬度增加，但是需要控制用量。番茄果實(shí)總色差值ΔE表示番茄果實(shí)色澤指標(biāo)，總色差值隨著處理組施加菌液濃度的增加表現(xiàn)“增-降-增”的變化，T3處理最低，T6處理色差最高，較CK增加7 %，菌液能促使番茄果實(shí)中色素的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，使番茄顏色更加鮮亮。表3

表3 不同處理下番茄果實(shí)外觀品質(zhì)變化

2.3 不同處理對(duì)番茄果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

研究表明，VC含量隨著處理組菌液的增加，總體上呈上升趨勢(shì)，其中，T6處理組VC含量最高，每毫克蛋白質(zhì)較CK組多2.82 μgVC，增長(zhǎng)量為5 %。隨著菌液的添加，番茄紅素在果實(shí)中的含量上升顯著，它能有效的提高番茄果實(shí)中番茄紅素的含量，其中T6處理組含量最高，較CK組增加0.29 μg/mL，增長(zhǎng)16 %。

可溶性多糖與可滴定酸中對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)影響較大，T4處理后兩者在試驗(yàn)中都具有最高含量，分別為3.88和2.12 mg/mL，同時(shí)糖酸比比值增加到1.83，在各處理組中增速最大。T4處理組可溶性固形物含量占比6.47 %，較CK組增長(zhǎng)為16 %。pH基本無變化。可溶性蛋白含量的測(cè)定是果實(shí)品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要評(píng)定指標(biāo)，T3組可溶性蛋白含量最高，較CK組多4.25 g/L，增長(zhǎng)為36 %，LYT-5菌液能促進(jìn)番茄蛋白質(zhì)含量增加，且增幅顯著。表4

表4 不用處理下番茄營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化

2.4 不同處理對(duì)番茄果實(shí)生理活性的影響

2.4.1 不同處理對(duì)多酚氧化酶(PPO)的影響

研究表明，生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥施加后，番茄果實(shí)中多酚氧化酶含量雖然有起伏，但總體上基本不變，在T5時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)含量為91 U/g，僅比CK組多4.89 U/g，施用生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥后，番茄果實(shí)多酚氧化酶含量基本無變化。圖1

圖1 不同處理下多酚氧化酶(PPO)變化

2.4.2 不同處理對(duì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)影響

研究表明，在遭受寒冷、傷害等外界不利環(huán)境因素時(shí)，植物的防衛(wèi)系統(tǒng)例如苯丙烷類代謝被激活，苯丙氨酸解氨酶活性快速上升，經(jīng)過生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥施用后，T2和T3組中苯丙氨酸解氨酶含量大幅增加，分別為79.35和78.57 U/g，較CK組分別增加了219 %和216 %。此時(shí)果實(shí)能大幅度提高對(duì)外界傷害的抗性。圖2

圖2 不同處理下苯丙氨酸解氨酶(PAL)變化

2.4.3 不同處理對(duì)抗壞血酸過氧化物酶(APX)的影響

研究表明，T3處理組抗壞血酸過氧化物酶含量最高，為1.95 U/g，較CK組1.61 U/g增長(zhǎng)21 %。該處理組果實(shí)能對(duì)加工和儲(chǔ)存時(shí)產(chǎn)生的逆境能夠及時(shí)響應(yīng)，增加抗逆能力。圖3

圖3 不同處理下抗壞血酸過氧化物酶(APX)變化

2.4.4 不同處理對(duì)總超氧化物歧化酶(T-SOD)的影響

研究表明，超氧化物歧化酶在T4處理組含量為28.74 U/g，僅比CK組28.08 U/g多0.66 U/g，增長(zhǎng)3 %。圖4

圖4 不同處理下總超氧化物歧化酶(T-SOD)變化

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥施用會(huì)對(duì)番茄果實(shí)產(chǎn)生不同程度影響，與劉賓華[23]等研究的結(jié)論一致。與常規(guī)肥料相比，T4處理后番茄平均單果質(zhì)量提升15 %，果形指數(shù)增長(zhǎng)至0.87，生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥的合理配施后能增強(qiáng)番茄對(duì)養(yǎng)分的吸收與積累，可能是微生物通過代謝活動(dòng)提供給植物有益的生存環(huán)境，不僅促使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)吸收、積累，產(chǎn)量增加，更使果形更加美觀。番茄果實(shí)硬度與色差變化較小，分別提升2 %、2 %，增幅與姜莉莉?qū)嶒?yàn)結(jié)果近似[24]，生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥對(duì)番茄硬度、色差的影響不大。對(duì)番茄營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：番茄果實(shí)中VC含量基本無變化，僅提升4 %，遠(yuǎn)低于韓順斌等[25]試驗(yàn)結(jié)果，但可溶性多糖升高43 %，與韓順斌等試驗(yàn)結(jié)果相差提高較大。不同種類微生物肥料可不同程度促進(jìn)土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化為植物可直接吸收利用的形態(tài)，促進(jìn)植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生與積累，增加果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，但對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量具有不同的增長(zhǎng)效果。

在可滴定酸的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)T4處理組含量最高，為2.12 mg/mL，較CK組增長(zhǎng)7 %，同時(shí)糖酸比值最大，生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥可顯著提高番茄的可溶性總糖含量，但對(duì)可滴定酸含量影響不大，進(jìn)而使糖酸比比值升高，與文獻(xiàn)研究中可滴定酸含量下降不同[26]，可能是試驗(yàn)微生物代謝產(chǎn)物對(duì)番茄產(chǎn)酸能力影響不大。王書娟等[27]研究發(fā)現(xiàn)，微生物肥料的施用可提升可溶性固形物含量，但增幅低于本次試驗(yàn)結(jié)果(16 %)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T2、T3時(shí)可溶性蛋白最高，此時(shí)較CK組增加31 %、35 %，增長(zhǎng)效果顯著，與前人研究結(jié)果相同[28]。

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶等蛋白酶類的活性變化是評(píng)價(jià)番茄果實(shí)劣變程度的一個(gè)重要指標(biāo)，能夠消除番茄果實(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，有效減緩番茄果實(shí)腐敗變質(zhì)。郝陽[29]等研究發(fā)現(xiàn)，微生物肥料能夠促進(jìn)小麥、甘蔗等多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等不同的酶活性升高，提高抗逆能力，微生物代謝過程中產(chǎn)生的一種或者幾種物質(zhì)能夠被植物的免疫受體識(shí)別，激活果實(shí)多種抗性酶活性，提高免疫抗性。試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)。

4 結(jié) 論

貝萊斯芽孢桿菌LYT-5接入有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥中后，能穩(wěn)定存活，可有效制備生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，且合理配施后，能有效改善番茄果實(shí)品質(zhì)，增強(qiáng)生理活性。施用生物有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥后，番茄果實(shí)多酚氧化酶和超氧化物歧化酶可增長(zhǎng)6 %、4 %，T3時(shí)苯丙氨酸解氨酶含量可增加212%，抗壞血酸過氧化物增長(zhǎng)21 %，果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和抗逆能力顯著增強(qiáng)。在施用濃度達(dá)到T3(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)后，番茄果實(shí)品質(zhì)改善明顯，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)顯著提高，番茄果實(shí)采摘后適宜短期內(nèi)食用、加工等。與CK(常規(guī)肥料，300 kg/hm2)相比，此濃度后番茄果實(shí)具有較高的生理活性，抗逆性強(qiáng)，為運(yùn)輸保鮮減損方面奠定品質(zhì)基礎(chǔ)。T3(有機(jī)-無機(jī)液體復(fù)合肥，300 kg/hm2+菌液，15 L/hm2)及以上濃度適宜番茄種植期間的田間施肥管理。