血清GFAP水平與NBNA評分在新生兒HIE中的臨床價值

尹緒鳳，陳少軍，李文斌

1.湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院兒科，湖北十堰 442000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，湖北武漢 430030

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指在圍生期因各種因素導致窒息，進而引起胎兒或新生兒缺氧缺血性腦損傷[1]。多數學者認為新生兒HIE發病機制復雜，通常是多種機制相互作用導致的病理結果，主要包含因腦血流量降低、腦組織供氧不足繼而引發氧化應激反應、大腦興奮性氨基酸釋放、炎癥相關因子釋放、血腦屏障破壞等[2-3]。相關數據顯示，我國HIE的發病率為3‰～6‰，15%～20%的HIE患兒在新生兒期發生死亡，25%～30%的HIE患兒則出現嚴重、永久、不可逆性的神經功能障礙[4]。

HIE患兒的臨床癥狀是其主要診斷依據，對其進行臨床評估通常采用的是北京協和醫院鮑秀蘭教授提出的20項新生兒行為神經測定(NBNA)評分。該評分法結合了美國Brazelton新生兒行為測定和法國Ameil-Tison神經運動測定方法的優點，具有可操作性強、可信度高、靈敏度及特異度高的優點[5-6]。

目前HIE輔助檢查主要包括顱腦彩超、頭顱CT、核磁共振、腦電圖等，但是越來越多臨床研究發現，神經損傷標志物水平可預測神經系統是否存在病理損傷[7-9]，現已成為醫學研究熱點。神經損傷標志物大多是與神經組織密切相關的生物蛋白，當神經系統受到一定程度損傷時，此類生物蛋白將會發生特異性改變，常見神經損傷標志物有S100鈣結合蛋白B(S100B)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)和髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)等。GFAP是星形膠質細胞特異性細胞骨架蛋白，正常情況下，GFAP在細胞內或細胞外自發降解，通過腦脊液循環于腦室系統與脊髓中，血中GFAP水平較穩定；當腦部發生損傷后，星形膠質細胞大量增生導致GFAP表達增加，GFAP通過血腦屏障進入血液中，使得血中GFAP水平上調[10]。故本研究對不同病情嚴重程度、不同日齡足月HIE患兒的血清GFAP水平、NBNA評分情況及二者之間的相關性進行分析，以期對HIE患兒的早期診斷、病情嚴重程度、預后判斷以及指導臨床治療提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2019年12月湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院收治的90例診斷為HIE的新生兒作為HIE組，依據病情嚴重程度將患兒分為輕度組(40例)、中度組(28例)、重度組(22例)，并隨機選取同時期產科70例健康足月新生兒作為本臨床試驗對照組。本研究經湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院倫理委員會批準，各研究對象家屬均已簽署臨床試驗知情同意書。

1.2納入標準 HIE組納入標準：(1)所有患兒均為足月兒(胎齡37～42周)；(2)出生體質量2.5～4.0 kg；(3)患兒均符合2005年中華醫學會兒科學分會新生兒組制訂的HIE臨床診斷及分度標準[11]。對照組納入標準：(1)胎齡37～42周；(2)出生體質量2.5～4.0 kg；(3)有正常的Apgar評分；(4)孕母在妊娠期身體健康；(5)新生兒無先天畸形、窒息史及神經系統病癥等表現。

1.3方法

1.3.1標本采集及GFAP檢測 所有納入本研究的新生兒在日齡1、3、7 d時分別采集外周靜脈血2～3 mL。將采集的血液標本靜置5～10 min后離心，設置離心機轉速為3 000 r/min，離心時間為10 min，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清GFAP水平，人GFAP ELISA試劑盒(ab223867)由上海艾博抗公司提供。用已知濃度的GFAP抗體包被微孔酶標板，制成相對抗體，向包被單抗的微孔酶標板中依次加入待檢測血清標本、標準品，待檢測標本中的人GFAP與生物素和親和素相結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經徹底洗滌后加顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)顯色。TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉化成藍色，在終止液的作用下最終轉化為黃色。顏色的深淺與待測標本中GFAP水平呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標準曲線計算樣本中GFAP水平。

1.3.2NBNA評分 分別在新生兒日齡3、7 d時進行NBNA評分。NBNA評分內容包括新生兒行為能力、主動肌張力、被動肌張力、原始反射、一般評估5個部分共20項，以上每項評分有3個分度(0、1、2分)，總分0～40分，評分>35分為合格，評分≤35分則記為不合格，提示有腦損傷。

1.3.3資料收集 收集所有受試新生兒胎齡、出生體質量、性別、分娩方式等一般資料。

2 結 果

2.1各組一般資料比較 HIE各亞組和對照組間胎齡、出生體質量、性別比例、分娩方式比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2各組血清GFAP水平比較 同一時間點各組間血清GAFP水平差異均有統計學意義(P<0.05)，其中：日齡1、3 d時HIE各亞組均明顯高于對照組，日齡7 d時中、重度組高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；同一時間點HIE各亞組間兩兩比較比較，日齡1 d時重度組高于輕、中度組，日齡3 d、7 d時中、重度組高于輕度組且重度組高于中度組，差異均有統計學意義(P<0.016 7)。HIE各亞組不同時間點血清GAFP水平比較：輕度組日齡3 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡1、3 d時均有所下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；中、重度組日齡3、7 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡3 d時有所下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組新生兒血清GFAP水平變化趨勢圖

表2 各組間及不同時間點血清GFAP水平比較

2.3各組NBNA評分比較 日齡3 d時HIE各亞組NBNA評分均明顯低于對照組，日齡7 d時中、重度組明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，而輕度組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)；同一時間點HIE各亞組兩兩比較，日齡3、7 d時輕、中、重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢，差異均有統計學意義(P<0.016 7)；日齡7 d時，HIE各亞組NBNA評分均較日齡3 d時升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組日齡3、7 d時NBNA評分比較分)

2.4日齡3、7 d時的HIE組血清GFAP水平與NBNA評分的相關性分析 Pearson相關分析顯示，日齡3、7 d時，HIE組血清GFAP水平與NBNA評分均呈負相關(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。見圖2。

注：A、B分別為日齡3、7 d時HIE組血清GFAP水平與NBNA評分間關系散點圖。

3 討 論

HIE與感染性腦損傷、膽紅素腦病并稱為新生兒三大腦損傷疾病[12]。HIE發病機制復雜，是多種機制與途徑共同導致的急性或慢性腦損傷。HIE可發生在圍生期任何階段，分娩前、分娩時、分娩后的多種因素均可導致缺氧缺血性腦損傷[13-14]。而HIE新生兒的干預時機十分重要，臨床醫生需要早期發現其行為神經異常表現。因此，新生兒行為神經檢查是近20年來國際兒科領域重要進展及研究重點之一。通過對新生兒行為神經進行合理評估，可以全面、完善、精細地評估新生兒的精神狀態、行為能力和各種神經反射。目前我國通常采用北京協和醫院鮑秀蘭教授制訂的NBNA評分法。相對于其他行為神經評估法而言，NBNA評分簡單，培訓時間短，檢查時間僅需10 min，具有可操作性強，可反復測定，無痛苦，以及無傷害等特點，其結果可靠，靈敏度及特異度高。另一方面，NBNA評分是基于中國新生兒制訂，能更加全面地評價新生兒的行為能力，也是我國臨床上目前使用最為廣泛的一種新生兒行為神經評定方法。

隨著分子生物學快速發展，分子生物學病理診斷對早期發現病變有重要意義。疾病早期，血清標志物的出現往往早于組織學病變[15]，因此，在疾病早期加強對血清標志物檢測，有利于更早發現異常，進而彌補目前傳統輔助檢查的缺陷與不足。基于此，神經損傷標志物在臨床上對HIE患兒早期診斷具有指導意義。現今為止，已有超過120種血清神經損傷標志生物蛋白被具體描述[16]，臨床研究較多的神經損傷標志物主要包括GFAP、NSE、S100B、UCHL-1、MBP等。其中，GFAP是星形膠質細胞中的一種細胞骨架蛋白，在神經再生和維持星形膠質細胞形態功能正常具有重要作用[17]。星形膠質細胞神經元與毛細血管壁共同組成了中樞神經系統的血腦屏障，因此，腦脊液或血清中GFAP水平在一定程度上可反映血腦屏障功能[18]。當中樞神經系統受損后，星形膠質細胞活化增生，主要表現為GFAP快速合成，并且在血清中或腦脊液中水平增加。因此，有學者認為，星形膠質細胞激活增多可以間接反映出神經損傷的嚴重程度，故血清或腦脊液GFAP水平可作為評估腦部受損與否及受損程度的新型指標[19]。

本研究通過對不同日齡各亞組HIE患兒血清GFAP水平進行檢測，發現不論其病情輕重，在日齡1 d時，血清GFAP水平較對照組均有所上升(P<0.01)，提示HIE患兒發病早期，血清GFAP水平即發生異常。對不同病情嚴重程度HIE患兒血清標本進行檢測分析發現，血清GFAP水平在日齡3、7 d時隨病情嚴重程度加重而升高，即輕度組低于中度組，中度組低于重度組，與既往的研究結果相一致[9]。另外在不同時間點對HIE各亞組血清GFAP水平進行比較，日齡3 d時血清GFAP水平最高，考慮其原因可能為此階段大腦處于損傷極期，腦組織及神經元發生壞死、腦水腫、腦出血、腦梗死等病理改變，致使血腦屏障通透性增加，星形膠質細胞內鈣超載，細胞功能穩態受破壞，細胞內環境發生改變，星形膠質細胞的壞死及活化增生刺激GFAP大量合成釋放，導致血清GFAP水平升高。有臨床試驗表明，HIE患兒在出生后3～4 d血清GFAP水平的變化可預測其腦損傷程度及遠期的運動發育狀況[10]。

本研究對納入的研究對象進行NBNA評分，結果顯示HIE組不論病情輕重，在日齡3 d時NBNA評分均低于對照組(P<0.01)，且HIE各亞組間比較，日齡3、7 d時輕度組、中度組和重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢(P<0.016 7)；當日齡7 d時，輕度組HIE患兒NBNA評分有所恢復，與對照組新生兒差異無統計學意義(P>0.05)，而中度組與重度組依然低于對照組(P<0.016 7)。本研究中HIE各亞組的NBNA評分在日齡3 d時NBNA評分低，提示對日齡3 d以內的HIE患兒應仔細觀察其行為神經狀態，并予以適當的良性刺激，改善患兒預后。

本研究分析了日齡3、7 d時HIE患兒GFAP水平與NBNA評分的相關性，結果提示血清GFAP水平越高，患兒NBNA評分越低，二者呈明顯負相關(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。研究表明，HIE患兒中樞神經系統損傷的主要原因之一為大腦缺血區域細胞死亡范圍擴大導致的再灌注損傷，而再灌注損傷發生時間為30 min到72 h不等[20]。因此，在日齡3 d時，HIE患兒在此時的腦損傷程度可能最為嚴重，大腦處在極度缺氧缺血狀態，成熟的星形膠質細胞大量合成、分泌GFAP，故此時血清GFAP水平最高，且此時神經行為功能低下，致使NBNA評分最低。在經過積極治療后，HIE患兒的缺氧缺血狀態得到改善，神經元細胞再次得到營養供給，神經系統功能得以恢復，此時的血清GFAP水平有所下降，而NBNA評分也相應上升。

綜上所述，HIE患兒的血清GFAP水平與NBNA評分呈負相關，提示兩個指標可共同作為HIE患兒早期診斷指標并反映其病情嚴重程度，可以指導治療，對降低HIE患兒的病死率有重要意義，從而輔助改善HIE患兒的預后。但本研究只觀察了日齡7 d內的HIE患兒血清GFAP水平及NBNA評分情況，時間較短，對預測HIE患兒預后價值有限，需進一步行隨訪研究。