蘇姜豬SIRT7基因組織表達定位分析

王利紅，張 偉，2，陳圣源，朱 軍

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場,江蘇泰州 225300)

Sirtuin是一類NAD依賴的去乙酰化酶，具有Mono-ADP-Ribosyl轉移酶活性，廣泛分布于原核生物和真核生物中。真核生物Sirtuin家族基因共有7個成員，為～，這些成員被劃分為4種類型，其中，、和為Ⅰ型，為Ⅱ型，為Ⅲ型，和為Ⅳ型。具有RNA聚合酶Ⅰ和包含組蛋白在內的多種rRNA活性緊密相關的生物學功能，如通過去乙酰化組蛋白底物和非組蛋白底物，參與細胞內的DNA損傷修復、抑制癌細胞增殖、誘導細胞衰老等過程。除NAD依賴的去乙酰化活性，還表現出其他的酶活性，如對H3K122去琥珀酰化、對H3K36/K37去丁酰化、對H4K91去戊二酰化、對SP7/Osterix去丙酰化及具有脫脂酰基轉移酶活性等。Grob A等研究表明，在細胞的有絲分裂過程中，通過的C端區域被磷酸化，對rDNA的轉錄發揮調控作用；Vakhrusheva等研究證實，的表達水平與小鼠細胞系中腫瘤的發生緊密相關，在嚴重的應激情況下抑制細胞的生長，保證細胞能夠盡量維持機體重要的新陳代謝通路。目前，有關豬基因表達研究較少，以蘇姜豬為研究對象則鮮有報道。蘇姜豬具有增質量快、瘦肉率高、繁殖性能強、肉質好等特點。本研究以成年蘇姜豬為研究對象，檢測分析()基因在多種臟器組織中的表達分布規律，研究結果可為豐富豬基因功能，深入開展該基因在蘇姜豬臟器中的作用及對生長發育的影響研究提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

于2020年4月在江蘇姜曲海種豬場隨機選取同一日齡健康無病的育成蘇姜豬(約90 kg)3頭；屠宰采集心臟、肺、腎臟、肝臟、脾、胃、大腸、小腸、腹部脂肪、腿肌、背最長肌共11種組織樣，每種組織樣各采集3個重復，存于液氮中，用于組織中基因轉錄和翻譯水平檢測；同時，再采集各臟器組織樣福爾馬林溶液固定后用于組織中蛋白表達定位檢測。

1.2 實時熒光定量(RT-PCR)檢測

由表1可知，根據GenBank中豬基因序列(登錄號：NM_001114272.1)和內參基因-(登錄號：KU672525.1)，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設計RT-PCR引物；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

表1 引物序列信息

使用TRIsol(Takara)提取所有組織樣品中總RNA，并反轉錄成cDNA(按試劑盒說明操作)。

RT-PCR反應體系為20.0 μL，其組成由表2可見。反應條件為：95 ℃1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40 個循環。

表2 RT-PCR反應體系組成

1.3 酶聯免疫分析(ELISA)

取組織樣約1.0 g勻漿后離心取上清液，按照SIRT7 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，在 450 nm 波長下測量吸光度值(值)。

1.4 免疫組織化學染色分析

將石蠟組織樣脫蠟、水化后，采用Tris-EDTA抗原修復，微波加熱10 min，TBS洗滌，采用HO封閉過氧化物酶，Sirtuin 7抗體4 ℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗識別特異性一抗，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水封片后鏡檢。

1.5 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 蘇姜豬組織中SIRT7 mRNA相對表達量分析

采用實時熒光定量方法檢測蘇姜豬11個組織樣中mRNA的表達量，采用2-ΔΔ法計算，以心臟中表達量定為1，并相對定量其他組織樣中表達水平。

由圖1可知，蘇姜豬腸組織(大腸和小腸)中mRNA表達量顯著高于其他組織中表達量(<0.05)；其次，在胃和腎臟組織中有較豐富的表達，顯著高于其余組織中表達量(<0.05)；在肌肉組織(背最長肌和腿肌)中表達量相對最低。

2.2 蘇姜豬組織中SIRT7蛋白表達量分析

通過酶聯免疫吸附測定方法，對蘇姜豬11個組織樣中SIRT7蛋白表達水平進行檢測，由圖2可知，蘇姜豬腸組織(大腸和小腸)中SIRT7蛋白表達量相對最高，顯著高于除胃組織的其他組織樣(<0.05)；其次是在肝臟、肺、脾、腎中有較豐富的表達；在心臟、腹脂和肌肉組織(背最長肌和腿肌)中SIRT7蛋白表達相對較少。

2.3 蘇姜豬組織中SIRT7 mRNA和蛋白表達量間相關性分析

蘇姜豬各組織中mRNA與蛋白表達量進行相關性分析，Pearson’s相關系數為0.810，=0.000，表明蘇姜豬組織中mRNA和蛋白表達量間存在極顯著相關(<0.01)。

2.4 蘇姜豬組織中SIRT7蛋白的定位分布

采用免疫組織化學方法檢測蘇姜豬各臟器組織中SIRT7蛋白免疫陽性顆粒的表達定位分布，由圖3可知，在蘇姜豬各臟器組織中，SIRT7蛋白主要分布于肝、腹部脂肪、骨骼肌細胞的細胞質及脾臟的紅髓區和紅白髓區交界處細胞、腎臟組織近遠曲小管細胞、肺支氣管上皮細胞和肺泡細胞。在消化道系統的胃和腸組織的肌層細胞及黏膜層胃腺和腸腺細胞中分布有較多的SIRT7免疫陽性顆粒。

3 討論與結論

SIRT7作為沉默蛋白Sirtuin家族成員，除去乙酰化酶活性外，還具有去琥珀酰化、去丁酰化、去豆蔻酰化等酶活性，在動物機體的生長發育和新陳代謝過程中具有重要的調節作用。Jin等在通城豬的腦、消化系統和脂肪等16種組織中檢測到mRNA的廣泛表達。本研究在蘇姜豬的11個組織樣中檢測到基因在轉錄和翻譯水平的表達，這與Jin等的研究結果相似，進一步證明該基因在豬臟器組織中的表達具有廣泛性。對比蘇姜豬組織中表達量，結果表明該基因在轉錄與翻譯水平間存在極顯著正相關性(<0.01)。

沉默蛋白Sirtuin家族的第7個成員(SIRT7)作為細胞內調控蛋白，其表達水平與細胞的代謝活動過程緊密相關，如在嚴重的應激情況下SIRT7可抑制細胞的生長。在細胞能量狀態的調節過程中，SIRT7與RNA Pol I結合并通過NAD依賴的方式激活rDNA轉錄，過表達SIRT7促進RNA Pol I介導的基因轉錄，干擾SIRT7則起到抑制效果。Ford等研究發現，SIRT7主要在人體代謝活躍的組織，如肝、脾中有較高表達，在非增殖性組織，如肌肉、心臟和大腦中，SIRT7表達水平相對較低。本研究檢測結果顯示，蘇姜豬消化系統如胃、大腸、小腸中有較高的SIRT7表達量，顯著高于其他組織中表達量(<0.05)，其次是腎臟、肝臟、脾臟和肺組織，在非增殖性組織如肌肉和心臟組織中表達量相對最低。Jin等在通城豬的消化系統中也檢測到較豐富的mRNA相對表達量。SIRT7蛋白主要分布于胃、大腸和小腸組織的消化腺細胞中，這表明消化腺細胞在利用其從周圍血液中吸收的原料合成消化液，并分泌及貯存的主動活動過程中，基因具有重要的調控作用，其具體機制有待后續深入研究。

腎臟組織中沉默蛋白Sirtuin家族的第7個成員(SIRT7)可以去乙酰化KCC4，以維持腎臟集合管室中酸堿平衡。在蘇姜豬的腎臟組織中，檢測到僅次于消化系統的相對較高的SIRT7表達量，然而，Jin等在通城豬的腎臟組織檢測相對較低的SIRT7 mRNA表達量，這種表達差異可能與不同品種豬的生理特征差異有關。經免疫組化檢測，SIRT7蛋白主要表達分布于蘇姜豬除腎小球外的近遠曲小管細胞中，表明該基因的功能主要與腎臟近遠曲小管的吸收與分泌功能有關。SIRT7是葡萄糖代謝的主要傳感器，Sun等發現，葡萄糖饑餓會激活AMPK，使SIRT7 T153發生磷酸化，繼而通過REG-蛋白酶途徑降解，從而減少rDNA轉錄及蛋白質合成以避免細胞死亡。SIRT7缺失增加肝細胞內質網應激，導致肝脂肪變性，進而導致血脂異常。Jin等在通城豬的肝臟和3種不同部位的脂肪(腹脂、內臟脂肪、皮下脂肪)組織中均檢測到SIRT7表達，本研究在蘇姜豬肝臟和腹部脂肪細胞中也檢測到SIRT7的表達，但其表達量相對較少。在蘇姜豬肺組織中SIRT7蛋白主要分布于支氣管黏膜層和肺泡細胞，其表達量相對較少，這與通城豬肺組織中相對較少的Sirtuin 7表達量結果相似；在脾臟組織中，SIRT7主要分布于脾紅髓區和脾紅白髓區交界處細胞，表明其主要參與脾臟組織免疫細胞的吞噬過程。

總之，SIRT7在蘇姜豬組織中的表達具有廣泛性，在消化系統中的表達量相對最高，顯著高于其他組織中表達量(<0.05)；蘇姜豬組織中SIRT7轉錄水平與翻譯水平間存在極顯著正相關(<0.01)；SIRT7蛋白主要分布于肌細胞、胃腺和腸腺細胞、肝細胞、脂肪細胞、脾臟紅髓區細胞、腎臟近遠曲小管細胞、肺支氣管上皮細胞和肺泡細胞中，表明基因主要與各臟器組織細胞的物質能量代謝和消化液分泌功能有關。