叢枝菌根真菌對鹽漬土辣椒生長、生理代謝及土壤無機磷組分的影響

侯殿明

(河南農業職業學院，河南中牟 451450)

土壤鹽漬化已成為影響植物生長發育及土壤健康的全球性問題。鹽脅迫帶來的滲透脅迫、離子失衡和pH值脅迫等不利影響可貫穿植物幼苗到成熟各個生長發育環節。在綠色植物中，鹽堿脅迫可對光化學反應產生不利影響，導致氣孔關閉、細胞間CO濃度增加以及活性氧(ROS)積累等，從而嚴重破壞植株正常的生理代謝。植物擁有各種酶促和非酶促抗氧化劑，可以通過不同生化步驟緩解過量ROS累積給細胞帶來的不利影響。超氧化物歧化酶(SOD)是消除超氧自由基的初始酶，其可催化超氧陰離子歧化為HO，隨后HO被過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)轉化為HO和O，從而有效緩解環境脅迫。

磷(P)是植物生長必需的礦質元素之一，同時也是不可再生資源。盡管許多地區的土壤P存量處于高儲量狀態，但土壤中的P礦化受到多因素影響使得作物產量受到P缺乏的限制。在南方地區，土壤多呈酸性，當土壤pH值為5.55～5.91時，人為施入土壤的可溶性磷酸鹽容易被土壤中存在的鋁離子、鐵離子和鈣離子固定形成閉蓄態P，從而進一步降低植物的P獲取量。在鹽漬土中，因Na水平過高，土壤中磷酸鈣的固定和金屬螯合作用較強，使得有效P水平變化較大且可用性低。根際微生物是一類生存在植物根系微域土壤的重要功能菌，可顯著影響微鹽漬土壤中可溶性磷的存在形態，研究表明，這些根際微生物可用作生物肥料，促進植物生長和P吸收。土壤微生物可以形成復雜的生態群落，通過其代謝活動和植物相互作用影響植物的生長發育，包括分解、養分循環轉化和大部分的土壤轉化過程。

叢枝菌根真菌(AMF)是一類廣泛存在于土壤的重要功能性微生物，AMF可幫助植物吸收土壤中的礦質養分、協調生理生化代謝以及促進宿主水分利用效率等，其中對植物P營養狀況的改善尤為突出。先前的研究表明，AMF可與植物根部和延伸的菌絲形成穩定的共生關系，可以雙向提高共生系統的養分和水分利用效率。同時，這些菌絲可以調節植物代謝(如抗氧化酶和過氧化物)以減輕環境對植物的損害，從而提高植物對環境脅迫的耐受性。辣椒(L.)為茄科辣椒屬一年生草本植物，具有較高的生物活性功能物質，是我國種植最為廣泛的蔬菜作物之一，具有較高的經濟應用價值。然而，目前關于AMF對逆境脅迫下辣椒的生長及P養分吸收知之甚少。基于此，本研究探索AMF施入量對辣椒生長發育、生理代謝及磷形態的影響。研究結果可為AMF應用于辣椒的施肥措施及可持續發展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年7—9月在河南農業職業學院園藝大棚中進行。供試辣椒品種為艷紅323F3，種子來自河南省農業科學院園藝研究所。

AMF接種菌劑由摩西斗管囊霉()、幼套近明球囊霉()及明根孢囊霉()混合而成，這3種菌株均購自北京農林科學院植物營養與資源研究所。

試驗地土壤類型為中壤土，0～20 cm土層土壤理化性質：pH值為7.64，全氮含量為1.11 g/kg，堿解氮含量為64.7 mg/kg，有效磷含量為21.42 mg/kg，速效鉀含量為124.16 mg/kg，電導率為216.52 μS/cm，Na含量為5.5 mg/kg，為中等土壤鹽水平。

1.2 試驗設計

試驗設置單因素5水平完全隨機試驗設計，因素為施用叢枝菌根真菌菌劑(AM)，水平分別為0、20、40、60、80 g/kg，分別記為CK、AM20、AM40、AM60、AM80。每個處理重復3次。

盆栽裝置為聚乙烯塑料桶，盆高20 cm，上口徑15 cm，底徑13 cm。每盆裝土3 kg，按各處理的AMF施用量將菌劑與土壤混合均勻。將種子在5%雙氧水中浸泡2～3 min，表面消毒3次，再用無菌蒸餾水清洗數次，每盆施用種子9粒，發芽7 d后間苗至3株。辣椒株距40 cm，此后，每2周向盆缽中加入50 mL 0.5 mol/L Hoagland’s營養液且不定時適量加水，試驗其他管理措施同辣椒生產操作規程，培養50 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 辣椒生物量及根系AMF侵染率、植株生物量、磷含量及農藝性狀測定 培養結束后，將根系切成 1 cm 長的小段，采用品紅溶液染色，光學顯微鏡下用網格交叉記數法計算AMF侵染率，具體方法參照Phillips描述的方法。

收獲全部盆栽中的植物，將辣椒地上部、根系分離，置于烘箱中殺青30 min，70 ℃烘干至恒質量并稱量記錄。農藝性狀包括株高、葉片指數，測量方法同常規農作物農藝性狀測量。每個處理重復3次。干物質測定完畢后，將植株粉碎處理，采用HSO-HO消化后采用釩鉬黃比色法測定植株磷含量。

1.3.2 辣椒光合色素、抗氧化物質含量測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量采用苯酚-硫酸法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，光合色素包含葉綠素a、葉綠素b，兩者皆采用丙酮-乙醇混合浸提法測定，具體步驟參照高俊鳳的方法。

1.3.3 土壤磷形態含量測定 培養結束后，從每個處理的3次重復中收集根際土壤樣品。使用鐵鍬將包含根系的辣椒植株挖出，去除距離根系過遠的土壤，從根部附近(0.5～2.0 cm)收集非根際土壤。為了收集根際部分，將整個植物從土壤中取出并輕輕搖動擺脫松散的土壤，接著進一步加重搖動以分離附著的根際土壤。根際土壤通過0.15 mm網篩采用NaOH熔融后鉬銻抗比色法進行全磷測定。通過2 mm網篩進行其他磷形態分析，有效磷(A-P)、閉蓄態磷(O-P)、無機形態磷(Fe-P、Al-P、Ca-P、Ca-P、Ca-P)含量的測定參考蔡鑫淋等的方法進行。

1.3.4 辣椒氧化酶相關基因及磷吸收基因表達水平測定 根據目前GenBank序列數據庫公布的辣椒(L.)轉錄組序列信息得到抗氧化酶相關的酶基因(-、、)。根據以上基因的序列借助Primer Express 5.0軟件設計擴增引物(表1)。根據Tan等報道的AMF介導的主要磷吸收基因，看家基因為，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96實時檢測系統進行定量PCR檢測。相關的RNA抽提和cDNA擴增、檢測及反應體系參照董桑婕的方法。相對表達水平采用2-ΔΔ算法進行計算。

表1 qRT-PCR 引物序列信息

1.4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據整理，采用DPS 14.0軟件進行單因素方差分析(=0.05)，采用Origin 9.1軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 施入叢枝菌根真菌對辣椒侵染的影響

由圖1-A可知，未接種AMF處理無侵染情況，在接種處理中(AM20、AM40、AM60、AM80)菌根侵染率為49.73%～68.55%，各處理表現為AM80>AM60>AM40>AM20，且與AM20處理相比，AM40、AM60、AM80處理分別增加8.15、16.63、18.82百分點，其中AM60、AM80處理顯著大于AM20處理。由圖1-B可知，對AMF施用量與侵染率進行線性相關分析發現，二者呈顯著正相關關系(=0.975、<0.05)，即隨著AMF施用量增加，侵染率隨之提高。

2.2 施入叢枝菌根真菌對辣椒生長參數的影響

由表2可知，干物質累積量中，以AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)較高，但AM處理間皆無顯著差異；與CK處理相比，AM20、AM40、AM60、AM80處理的干物質分別顯著提高31.88%、65.27%、34.01%、26.38%。農藝性狀中，各處理株高表現為AM40>AM20>AM80>AM60>CK，其中AM20、AM40處理無顯著差異，且兩者皆顯著大于其他處理；葉面積仍以CK處理最低，接種AMF的處理較其增加16.97%～65.36%，其中AM40、AM60處理顯著大于CK處理；莖粗中，處理間差距較小，兩兩處理間皆未達顯著差異水平。

表2 施入叢枝菌根真菌對辣椒農藝性狀及葉綠素含量的影響

就葉綠素含量而言，葉綠素a含量以高AMF施用量處理(AM40、AM60、AM80)較高，三者間無顯著差異，且AM40處理顯著大于CK、AM20處理。各處理葉綠素b含量以AM60處理最高，為0.89 mg/g，AM40、AM80處理其次(0.86 mg/g)，三者間無顯著差異，且皆顯著大于CK、AM20處理。葉綠素a+b含量仍以CK處理最低，各處理表現為AM40>AM60>AM80>AM20>CK，與CK處理相比，接種AMF處理的葉綠素a+b含量顯著提高3.94%～15.75%，且AM40、AM60、AM80處理均顯著大于AM20處理。

2.3 施入叢枝菌根真菌對辣椒抗氧化系統參數的影響

由圖2-A可知，丙二醛含量中，以CK處理最高，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)分別較其顯著降低50.6%、56.02%、52.22%、36.76%，其中AM80處理顯著大于其他AM處理。由圖2-B可知，可溶性糖含量以CK處理最低，顯著低于其他處理，以AM60處理最高，AM80處理其次，二者無顯著差異，且皆顯著高于CK、AM20處理。可溶性蛋白含量中各處理順序表現為AM60>CK>AM40>AM20>AM80，但處理間皆無顯著差異(圖2-C)。

抗氧化酶相關基因中，超氧化歧化酶基因(-)以AM20處理表達水平最高，但AM處理間均無顯著差異，且與CK處理相比，AM處理顯著提高100.12%～183.52%(圖2-D)。過氧化氫酶基因()相對表達豐度則以AM40處理最高，為4.85，其他處理較其顯著降低51.34%～80.21%，此外AM60處理顯著大于AM20和CK處理(圖2-E)。過氧化物酶基因()的表達水平，各處理表現為AM60>AM40>AM20>AM80>CK，且與CK處理相比，AM20、AM40、AM60、AM80處理分別顯著提高234.51%、280.99%、535.21%、172.54%，其中AM60處理顯著大于其他AM處理(圖2-F)。

2.4 施入叢枝菌根真菌對辣椒土壤磷組分及總磷含量的影響

根際土壤無機磷組分分為有效磷(A-P)、鈣態磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)、鐵磷(Fe-P)、鋁磷(Al-P)、閉蓄態磷(O-P)和總磷(TP)。由圖3-A可知，就磷組分含量來看，鈣磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是鹽漬土壤中的主要P組分，其組分含量占總組分的54.89%，各組分含量表現為Ca-P>O-P>Ca-P>Ca-P>A-P>Al-P>Fe-P，表明Ca-P是土壤中的主要磷組分。就處理來看，不同處理在不同磷組分中的規律不盡一致。整體而言，與CK處理相比，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)整體提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P的含量，其增幅分別為33.14%～56.34%、7.67%～35.92%、38.26%～75.84%、4.77%～44.39%、4.51%～36.22%，但在 Ca-P、Ca-P中的效果不明顯；此外，試驗數據表明，與CK處理相比，AM處理降低了O-P和 Ca-P的含量，其降幅分別為13.79%～25.59%、3.38%～9.17%。從土壤全磷含量來看，各處理表現為AM80>AM60>AM40>AM20>CK，但處理間均無顯著差異(圖3-B)。

2.5 施入叢枝菌根真菌對辣椒磷吸收量及相關基因表達的影響

由圖4-A可知，各處理辣椒植株磷含量表現為AM40>AM20>AM60>AM80>CK，其中AM40、AM20處理二者間無顯著差異，其他處理較AM40、AM20處理分別顯著降低10.02%～17.88%、13.03%～20.63%；以CK、AM80處理最低，二者無顯著差異且分別比AM60處理顯著降低8.74%、7.14%。在磷吸收基因中，CK處理的相對表達豐度為1.13，AM處理下該基因的表達水平顯著增加377～1 787倍，其中AM40處理的表達水平最高，顯著大于其他處理，AM20處理其次，其大于AM60、AM80處理，其中與AM80處理達顯著差異水平。

2.6 施入叢枝菌根真菌條件下磷指標間的相關性分析

從辣椒植株磷指標及土壤磷指標間的相關性分析結果(表3)可知，Ca-P含量與土壤全磷、O-P含量呈極顯著負相關；O-P含量與Ca-P、Fe-P、Al-P、A-P含量及表達水平均呈顯著負相關；Fe-P含量與Al-P含量、表達水平與植株磷含量均呈極顯著正相關；表達水平與Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量與Ca-P、A-P 含量，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量均呈顯著正相關。

表3 施入叢枝菌根真菌條件下磷指標間的相關性分析結果

3 討論與結論

土壤鹽堿脅迫可通過抑制一系列生理生化代謝從而限制植物的生長發育，同時，植物也已經進化出一系列防御機制來適應環境脅迫，這涉及酶促反應和滲透物質。較長時間的鹽脅迫會誘導活性氧的過量產生，從而導致脂質、DNA、RNA和蛋白質過氧化，最終導致細胞死亡，接種AMF有助于減緩由過氧化對植物細胞造成的損害。本研究結果表明，在鹽漬土中施用AMF菌劑使辣椒幼苗的超氧化歧化酶基因(-)、過氧化氫酶基因()和過氧化物酶基因()表達水平發生明顯上調，且增加了可溶性糖含量，減少了MDA的積累。前人研究表明，AMF可以通過調節酶基因(如、)和非酶促基因(如、)來消除活性氧。其他研究表明，接種AMF可以提高脅迫條件下核桃幼苗中滲透物質的水平，有助于減緩環境脅迫造成的損傷。然而，對于辣椒植株，這種作用體現在可溶性糖含量上，但在可溶性蛋白含量上不明顯。這表明，在施用AMF后，滲透物質調節不是增強辣椒幼苗耐鹽性的主要途徑。

普遍認為，與土壤微生物構建有益的共生關系是陸生植物應對非生物脅迫的較佳策略之一，然而微生物與植物在相互促進的本質是物質交換，因此共生關系隨著環境條件變化以及植物生長、衰老和死亡而發生變化。本研究中，施用不同用量的叢枝菌根真菌均在辣椒幼苗根系上表現出較高的侵染率(49.73%～68.55%)，線性相關分析結果表明，AMF施用量與侵染率呈顯著正相關，即AM80處理侵染率最高。然而在干物質、農藝性狀及葉綠素含量等生長參數中，AM80處理沒有表現出最好的促進效果，這表明侵染率與辣椒植株長勢之間沒有明顯的趨同性。就試驗數據來看，AM40處理在干物質量、株高、莖粗及葉綠素總量中具有最大值，同時明顯高于AM80處理。這可能是因為較高密度地接種AMF可能會降低或不平衡關鍵植物激素的濃度，此外，菌根共生的主要驅動因素是植物光合碳產物與菌絲礦質養分的交換，較大的AMF群體也意味著植物需供給較多的碳產物，因而多方面影響著宿主植株的生長。

土壤P素是植物生長發育所需的重要礦質元素，土壤P組分及其含量是決定土壤P供給水平的關鍵。本研究結果表明，鈣磷(Ca-P、Ca-P、Ca-P)是鹽漬土壤中的主要P組分；研究結果進一步表明，與CK處理相比，AM處理(AM20、AM40、AM60、AM80)整體提高了Al-P、Fe-P、A-P、Ca-P、Ca-P含量，降低了O-P和Ca-P含量。此外，在本研究中，磷基因()和磷吸收量在施用AMF菌劑后整體提高，且峰值皆出現在AM40處理。本研究中，相關性分析結果表明，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量呈正相關，Fe-P含量與Al-P含量呈正相關，O-P含量顯示與Ca-P、Fe-P和Al-P含量呈負相關，表達水平與Ca-P、Al-P、A-P含量，植物磷含量與Ca-P、A-P含量，A-P含量與Ca-P、Ca-P含量均呈顯著正相關。這表明施用AMF菌劑可以將不溶和難溶性P(O-P、Ca-P)活化為可用P(A-P、Ca-P、Ca-P)和緩速P(Fe-P、Al-P)，從而為植株P吸收提供來源。可能原因有：(1)AMF可以形成一個致密的菌絲網絡，影響植物間的養分流動，且磷酸鹽離子在菌絲內擴散速度比在根毛中更快，加速磷在土壤中的擴散；(2)AMF可影響呼吸或有機酸(如草酸、檸檬酸等)分泌過程中的H分泌將不溶或難溶性P轉化為可溶性P形態；(3)AMF能夠誘導P轉運蛋白基因的表達，使寄主植物產生更多的磷轉運蛋白。

目前，AMF的接種量沒有統一的標準，確定接種量的一些常用方法是由接種潛力、單位體積的孢子密度或接種物的質量決定的。然而，在實際的大規模農業實踐中，AMF是在培養后使用的，不僅含有孢子，還含有菌絲、囊泡、菌根段等繁殖體，在接種時應加以考慮。本研究中，選擇傳統的孢子含量作為菌劑的施用指標，整體而言，40 g/kg 的施用量對混合菌劑的定殖率、辣椒幼苗生長和磷吸收與活化取得了最佳效果。這些結果為AMF菌劑在田間的應用提供了理論基礎。