抑制蠶豆鮮莢腐敗菌的生物保鮮技術

宋居易，陳 惠，張 欣，劉 暢

(江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇南通 226012)

蠶豆是我國重要的經濟植物，主要以鮮莢形式進入市場。蠶豆鮮莢在采摘后，由于受到溫度、自身酶的作用導致品質變差的報道較多，而受到微生物影響的報道較少。實際上，蠶豆鮮莢在采摘、加工、貯藏過程中會受到多種微生物的侵染，導致褐變、腐爛和變軟等，從而影響其風味、色澤、營養成分及貨架期。因此，如何高質量地延長其貨架期，對穩定市場、提高行業從業者經濟收益進而激發行業活力具有相當大的意義。

蠶豆鮮莢作為一種農產品，與人們的生活健康息息相關。因此，在蠶豆鮮莢生產中，研發和利用有效的、安全無毒的、純天然的、對環境友好的生物抑菌劑是研究熱點之一。-葡聚糖是一種純天然的抑菌物質，相關研究發現，-葡聚糖涂膜劑可以延長芒果、番茄等果蔬的貨架期。植物精油是目前較熱點的植物源抑菌劑，相關研究結果表明，多種植物精油復合使用對黃豆芽中微生物、牛肉腐敗菌等有抑制作用。另外，溶菌酶、茶多酚是已被證明有良好效果的生物抑菌劑。

優勢腐敗菌(specific spoilage organism，SSO)是指在果蔬采摘、加工、貯藏過程中導致其品質變劣、占主導地位的部分微生物品種。通過抑制腐敗菌來選擇生物抑菌成分并進行復合保鮮的研究未見報道。筆者所在課題組已經從蠶豆鮮莢中分離出腐敗菌并進行了回染試驗，得到5種細菌(編號為B～B)和2種真菌(F、F)等7種優勢腐敗菌。本研究選擇元麥-葡聚糖與植物精油、溶菌酶、茶多酚等生物抑菌物質進行處理，通過研究對蠶豆鮮莢優勢腐敗菌抑制的效果，確定有效生物抑菌成分，并與植酸、甘油進行復配，最后用響應面法優化得出高效、低成本、安全的復合保鮮劑配方，以期為其在蠶豆鮮莢的貯藏保鮮方面的應用提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗時間為2021年4—6月。蠶豆鮮莢取自江蘇沿江地區農業科學研究所(地理位置：120°69′E，32°14′N)及附近農田。元麥-葡聚糖由筆者所在實驗室自制。食品級大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油，均購自鄭州雪麥龍食品香料有限公司。食品級茶多酚，購自索來寶生物科技有限公司。食品級溶菌酶和植酸，均購自浙江一諾生物科技有限公司。甘油，購自西隴化工股份有限公司。平板計數瓊脂、PDA和牛肉膏蛋白胨培養基等生化試劑，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-100CA型低溫生化培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3C pH計，購自上海儀電科學儀器股份有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺，購自北京賽伯樂實驗儀器有限公司；LS-30 型立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物抑菌成分的抑菌性檢驗 植物精油(大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油)用20%乙醇制成5%的母液，用元麥-葡聚糖、溶菌酶和茶多酚制成3%的母液，稀釋成不同濃度后使用。

將蠶豆鮮莢貯藏于點菜柜期間(溫度變化范圍為10～12 ℃)分離得到的7種優勢腐敗菌分別接種于細菌、真菌分離培養基上，按照Wang等的方法進行操作。

1.3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用Liu等的方法進行操作，測定不同生物抑菌成分對蠶豆鮮莢優勢腐敗菌的MIC。

1.3.3 保鮮劑成分用量的篩選 分別設置丁香精油含量為0.3%、0.5%和0.7%，元麥-葡聚糖的含量為0.5%、1.0%和1.5%，植酸的含量為0.05%、0.10%和0.15%，甘油的含量為1.0%、1.5%和2.0%，以無菌蒸餾水處理作為對照組。

1.3.4 復合保鮮劑濃度的響應面優化 根據單因素試驗的結果，按表1進行設計，以感官評定作為響應值篩選并進行驗證試驗。

表1 響應面試驗因素水平編碼

1.3.5 響應面優化復合保鮮劑驗證試驗 將蠶豆鮮莢分為2組進行裝袋：試驗組用經過優化的生物保鮮劑處理，對照組不加保鮮劑處理。分別于10 ℃貯藏20 d后，驗證生物保鮮劑的保鮮效果。

1.3.6 保鮮指標的測定

1.3.6.1 菌落總數 測定方法具體參照GB 4789.2—2016《食品衛生微生物檢驗 菌落總數測定》。

1.3.6.2 感官評價 感官評定團由6名有感官評定經驗的人員組成，總分在9分以下表示蠶豆鮮莢已不可食用。蠶豆鮮莢感官評分的具體指標見表2。

表2 蠶豆鮮莢的感官評定的具體指標

1.4 數據處理

用SPSS 24.0對試驗結果進行分析，用Origin 9.1作圖。

2 結果與分析

2.1 生物抑菌成分的抑菌效果

由表3可以看出，丁香精油對除B外的6種腐敗菌均有抑制作用，且抑菌效果均較好，覆蓋范圍最廣；元麥-葡聚糖、茶多酚均對B、B和B這3種腐敗菌有較好的抑制作用，但元麥-葡聚糖的抑菌效果明顯優于茶多酚，且元麥-葡聚糖也可以作為涂膜劑使用?；谝志鷱V譜性、抑菌效果及涂膜功能，本研究選擇丁香精油、元麥-葡聚糖作為生物抑菌成分進行下一步研究。

表3 8種生物抑菌劑對冷藏蠶豆鮮莢腐敗菌的抑菌圈直徑

2.2 生物抑菌成分對蠶豆鮮莢腐敗菌最小抑菌濃度的影響

各試驗組主要通過牛津杯法研究丁香精油、元麥-葡聚糖對7種腐敗菌的抑菌作用，得出相對應的MIC(表4)，從而確定單因素試驗中各因素的取值范圍。

表4 不同生物抑菌成分下的蠶豆鮮莢腐敗菌MIC

2.3 保鮮劑成分的單因素試驗結果

2.3.1 丁香精油用量的篩選 由圖1可知，0.3%丁香精油處理的抑菌能力、感官評分明顯比0.5%、0.7%丁香精油處理的低，可能是由其濃度低造成的，而0.5%丁香精油處理的感官評分在貯藏20 d內均最高，因此選擇0.4%～0.6%作為丁香精油適宜的保鮮含量范圍。

2.3.2 元麥-葡聚糖用量的篩選 如圖2所示，隨著元麥-葡聚糖濃度的增加，抑菌效果越好，1.5%元麥-葡聚糖處理的感官評分低于1.0%元麥-葡聚糖處理，這可能是由于高濃度的元麥-葡聚糖較黏稠，不易形成干燥的薄膜，因此選擇0.8%～1.2%作為元麥-葡聚糖的適宜用量范圍。

2.3.3 植酸用量的篩選 如圖3所示，0.05%植酸處理組比其他2個處理組的感官分值低，其他2組的差異不明顯，而且0.10%植酸處理組的感官分值更高一些。因此選擇0.08%～0.12%作為植酸適宜保鮮用量范圍。

2.3.4 甘油用量的篩選 由圖4可知，對照組的感觀評分值持續下降，貯藏10 d內添加甘油處理后，樣品的感官評分下降趨勢較緩慢。但是貯藏20 d后，樣品品質都下降，都超過規定標準，基本失去食用價值。在這個過程中，1.5%甘油處理組的感官分值更高一些，可能因為1.0%甘油形成的膜比較薄，抑制呼吸作用、水分損失的能力略差，而2.0%甘油形成的膜略厚，透氣性不好，因此選擇1.2%～1.8%作為甘油的適宜用量范圍。

2.4 響應面優化試驗結果

2.4.1 中心組合設計試驗結果 用Design-Expert 10.0對表5中的數據進行分析，得到感官評價分值對丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油用量這4個因素的二元回歸方程模型為=2489+108+072+040+030+049+003-014+009-008+017-132-194-142-120。式中：為感官評價分值；為丁香精油用量；為元麥-葡聚糖用量；為植酸用量；為甘油用量。

表5 響應面試驗方案及結果

如表6所示，該模型達到極顯著水平(<0.000 1)，失擬項不顯著，說明方程擬合程度較好；方差分析結果還說明，一次項都有顯著或極顯著影響，說明丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油用量4個因素對蠶豆鮮莢感官評價分值有很強的影響，影響感官評分的各因素排序為丁香精油用量>元麥-葡聚糖用量>植酸用量>甘油用量；交互項中AB達到顯著水平(<0.05)。

表6 回歸模型的方差分析結果

如圖5所示，丁香精油、元麥-葡聚糖的響應面圖形的曲線較陡，其等高線為橢圓形，說明兩者的交互作用顯著，即同時使用可以產生協同作用，從而起到更好的效果。

2.4.2 最優條件優化 根據Design-Expert 10.0分析和數據優化，得到最優工藝條件，以質量體積比計：丁香精油用量為0.48%，元麥-葡聚糖用量為0.80%，植酸用量為0.12%，甘油用量為1.20%。通過3次驗證試驗，保鮮處理20 d后的感官評分值達到23.18分，菌落總數為4.09 lg CFU/g，接近預測值，說明利用響應面法優化配方是可行的。按照最優工藝條件進行處理的蠶豆鮮莢明顯優于同等貯藏條件下未經過保鮮劑處理的，其感官評分為3.27分，菌落總數為8.23 lg CFU/g。劉小芳等研究發現，新鮮凈菜活菌數應低于5 lg CFU/g。由此可見，復合保鮮劑處理的樣品符合規定。

3 討論與結論

筆者在對元麥-葡聚糖進行研究的過程中發現，它對一些致病菌和腐敗菌有一定的抑制作用，經初步試驗，發現其在蠶豆鮮莢保鮮上也有較好的抑菌效果。元麥-葡聚糖的抑菌譜雖然沒有丁香精油廣，但是它們可以在抑菌種類在上形成互補；其次，它可以在蠶豆鮮莢上形成涂膜，減弱其呼吸作用，延緩后熟，這與閆子嬌等的研究結果相類似。加入甘油作為增塑劑，會與多糖共同作用，提高成膜品質，抑制果蔬呼吸和蒸騰作用，從而維持果實的品質。褐變是蠶豆鮮莢在采摘后極易發生的一種現象，酶促褐變是引發的主要原因之一。植酸是一種天然物質，具有抗氧化性和護色作用，從而達到保鮮的目的。

采用響應面法建立丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸、甘油用量與感官評分之間的二次多項回歸模型，得到優化的蠶豆鮮莢的保鮮劑配方，以質量體積比計：丁香精油用量為0.48%、元麥-葡聚糖用量為0.80%、植酸為0.12%和甘油為1.20%；在此配方下蠶豆鮮莢保鮮20 d后感官評價分值為23.18分，表明響應面法用于配方優化是可靠的。在此條件下，蠶豆鮮莢冷藏20 d期間，最佳配方試驗組在菌落總數、感官評分上均優于對照，表明丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油保鮮組合可延長蠶豆鮮莢的貨架期至20 d以上，同時為蠶豆鮮莢新型生物保鮮劑的研制提供依據。