星點設計-效應面法優(yōu)化胰蛋白酶提取魚腥草多糖的工藝研究

杜晶，游國葉，樊輕亞

（信陽職業(yè)技術(shù)學院，河南 信陽 464000）

鮮魚腥草為三白草科植物蕺菜屬蕺菜的新鮮全草或干枯的地上部分[1]，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，可治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱淋、熱痢、癰腫瘡毒等癥[2]。現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草具有抗腫瘤、抗病毒和抗炎等作用[3]。其水溶性多糖具有抗菌、抗病毒、提高機體免疫力和利尿等作用[4]。

目前魚腥草多糖未見CCD優(yōu)化胰蛋白酶提取魚腥草多糖的方法，本課題組以魚腥草為研究對象，采用星點-效應面優(yōu)化胰蛋白酶多糖提取工藝，旨在為魚腥草多糖相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2000紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠；天平，JYT-10型，上海醫(yī)用激光儀器廠；循環(huán)水真空泵，SHB3，上海申生科技有限公司；數(shù)顯鼓風干燥箱，GZX-9240MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電子天平，AY120，日本島津株式會社。

1.2 試劑與藥品

葡萄糖標準品，批號080621，Sigma公司；胰蛋白酶，批號081105，廣州市齊云生物生產(chǎn)；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇，均為分析純，苯酚試液參考文獻[5-7]配制。魚腥草全草購于河南藥材公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚腥草多糖提取方法的建立

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.099 g，加水溶解并定容至 100 mL，配制得質(zhì)量濃度為0.99 mg·mL-1的葡萄糖對照品貯備液。分別精密稱定葡萄糖標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶中加水至刻度線，搖勻，再分別取1 mL，加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸顯色40 min以上。另取1 mL蒸餾水，加同量苯酚和濃硫酸，同法操作，作為空白對照。置UV2000型分光光度計中，于490 nm測定吸收度，以吸收度（Y）對葡萄糖質(zhì)量濃度（X）進行回歸，得標準曲線方程:Y=8.428 6X-0.025 8，相關(guān)系數(shù)為0.995 9。結(jié)果表明葡萄糖在0.019 7～0.058 9 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

分別稱取魚腥草藥材5.0 g，按照星點設計表進行提取粗多糖，精密稱取于50 ℃烘干至衡重的粗多糖0.100 0 g，加水溶解并定容至50 mL，搖勻，再取1 mL定容至10 mL容量瓶中，得供試品，分別取供試品1 mL，置于試管中，加1 mL苯酚、5 mL濃硫酸，振搖均勻，顯色40 min以上。另取1 mL 蒸餾水，加同量苯酚和濃硫酸，同法操作嗎，作為空白對照。置UV2000型分光光度計中，于490 nm測定吸收度，求得多糖含量。

2.2 方法學考察

2.2.1 穩(wěn)定性試驗

取葡萄糖標準液0.8 mL，定容到10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法顯色，每隔20 min測定一次吸收度，連續(xù)2 h考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明供試液在2 h顯色穩(wěn)定，RSD=0.30%

表1 穩(wěn)定性試驗

2.2.2 精密度試驗

取葡萄糖標準液0.5 mL，定容至10 mL容量瓶中，再取1 mL，苯酚-硫酸法顯色，連續(xù)測定5次，測定結(jié)果見表2，RSD=1.4%，表明精密度良好。

表2 精密度試驗

2.2.3 重復性試驗

精密稱取50 ℃干燥至恒重的魚腥草粗多糖6份，分別置于100 mL的容量瓶中復溶，再取2 mL定容至10 mL，按標準曲線項下的方法操作，測定吸光度，結(jié)果見表3。

表3 重現(xiàn)性實驗結(jié)果（n＝6）

從表3結(jié)果可以看出，用苯酚-硫酸法進行魚腥草多糖的分析，重現(xiàn)性好，實驗結(jié)果可靠。

2.2.4 加樣回收率測定

精密稱取樣品5 g，加入精制多糖600 mg，精密稱定，按樣品制備方法操作，精密量取1.0 mL，苯酚-硫酸法顯色，于490 nm波長處用可見紫外分光光度計測定，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率測定

2.3 胰蛋白酶提取魚腥草多糖最佳條件的優(yōu)選

根據(jù)文獻報道[8-10]并結(jié)合實際，確定影響酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、溫度、時間等，在單因素實驗的基礎上以pH＝7和40倍魚腥草藥材體積水提取多糖，根據(jù)筆者單因素考察實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶的量、酶解溫度、酶解時間對魚腥草多糖的得率有顯著影響，故采取星點-效應面法[11-12]對其提取工藝進行優(yōu)化，根據(jù)星點設計原理對各因素進行了5水平設計，開展實驗，各因素水平分布見表5。

表5 星點設計因素水平表

使用Design Expert8.0.6版軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得多元線性回歸擬合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C，P=0.085 9，r=0.574 5。二項式擬合方程Y=21.48+0.66A-0.055B+2.71C-0.25AB+0.27AC+0.87BC-2.59A2-1.61B2-2.40C2，P=0.000 2，r=0.9612。二項式擬合方程的相關(guān)系數(shù)較高，表明該模型的擬合程度高，預測性好，因此選用二項式擬合模型來優(yōu)化實驗方案，進行方差分析，數(shù)據(jù)見表6。

表6 效應面二次模型的方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果顯示，該二項式擬合模型F=13.50，P＜0.01，表明該模型具有顯著性，=0.855 5，說明因變量和自變量之間有顯著的線性關(guān)系，由R2=0.923 9可知預測值和真實值之間有較高的相關(guān)性，綜上所述，該模型與實際情況的擬合程度較好，可用于評價魚腥草多糖的提取量的實際情況。

根據(jù)所擬合的二項式，應用CCD繪制各因素對多糖含量影響的三維效應面圖，見圖1。在酶添加量和酶解溫度交互三維圖中，當溫度一定，魚腥草多糖提取量隨著酶量的增加先增加后下降，當酶量不變時，隨著溫度的提升，多糖的提取量也是先升高再降低，多糖提取量比較高的范圍為，酶添加量（2.0，2.3），酶解溫度（43，45）；由酶加量和酶解時間交互圖可知，酶添加量（1.5，2.5）、酶解時間（144,180）的時候，魚腥草多糖的提取量高；由酶解溫度和酶解時間的交互圖可知，酶解溫度（42，48）、酶解時間（144，188）。再結(jié)合二次多項式擬合方程求偏導得到最佳提取條件為酶添加量為2%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為150 min，多糖的理論提取量為25.99，與實測值25.93基本相符，因此采用星點-效應面法得到的胰蛋白酶提取魚腥草多糖的提取工藝具有實際應用價值。

圖1 酶添加量、酶解時間、酶解溫度對胰蛋白酶提取多糖含量的影響

3 結(jié) 論

將星點-效應面法應用于胰蛋白酶提取魚腥草多糖提取工藝的優(yōu)化，結(jié)合單因素試驗，確定酶添加量、酶解時間、酶解溫度3個影響因素，然后采用星點-效應面對提取條件進行優(yōu)化，運用Design-expert 8.0.6軟件安排試驗并進行數(shù)據(jù)處理，所得提取條件（酶添加量為2%、酶解時間為150 min、酶解溫度為45 ℃）穩(wěn)定可控，工藝簡便，便于工業(yè)化操作，可謂魚腥草多糖的進一步研究提供科學依據(jù)。