4種冷凍保護劑對人指固有神經的玻璃化保存效果

李 智 戴依娜 王 成 陳世玖

全球急性手外傷發生率為0.15‰～3.15‰，手部神經損傷將導致神經傳導中斷，會導致肌肉萎縮失去功能、感覺功能障礙，造成手部功能喪失，嚴重影響患者生活質量[1]。修復手部損傷神經、重建手部神經功能意義重大。同種異體神經移植是理想的治療方案。本研究以患者放棄肢體的指固有神經作為研究對象，旨在評估甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇4種冷凍保護劑(cryoprotective agents，CAPs)的玻璃化保存效果，為人指固有神經玻璃化法保存提供一定的理論依據。

對象與方法

1.標本來源及處理:取在遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院因外傷行截肢手術后患者放棄的肢體(共6例上肢，腕部水平離斷1例，前臂離斷3例，上臂離斷1例，肩部離斷1例)，患者無高血壓、糖尿病及周圍血管神經病變。肢體置于無菌操作臺，剝離指固有神經至遠端指間關節，剪成長度為1cm的神經片段，共75個片段，隨機分為5組(4個實驗組分別為30%DMSO組、甘油組、乙二醇組、丙二醇組和1個空白對照組)。

2.玻璃化保存：以胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI1640培養液、各組對應種類CAPs，按體積比為1∶6∶3配置玻璃化凍存液。處理分組后的神經片段分別放入裝有4℃預冷的對應組的冷凍保護劑的凍存管中，在4℃中平衡30min，-20℃平衡2h，于-80℃冰箱過夜后投入液氮罐內深低溫保存3周。3周后取出，直接放入40℃的水浴中快速復溫，復溫后加入含有0.5mol/L的蔗糖溶液中，洗脫10min，0.25mol/L蔗糖溶液，再次洗脫10min。

3.HE染色光學顯微鏡觀察：每組取出5個標本，各截取0.5cm進行常規脫水固定、石蠟包埋、切片。按試HE染色劑盒(美國博士德生物公司)說明書進行染色操作，在400倍光學顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察神經組織結構。

4.玻璃化保存指固有神經的組織結構觀察：取0.5cm長度神經標本，各組5條，按Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)說明書進行孵化染色，防熒光淬滅劑封片，TCS-SP2 型激光掃描共聚焦顯微(德國Leica 公司)，分別在490nm、545nm波長下觀察熒光強度。

5.神經體外培養：復溫后指神經Hank′s液洗滌3次，置于8孔細胞培養板的培養孔中，每孔2.5ml含有10%胎牛血清，100U/ml鏈霉素的H-DMEM培養基， 37℃、5%CO2培養箱內培養7天，每2天更換培養液1次。

6.ELISA法檢測玻璃化保存后神經的NGF：取培養后神經用0.01mol/L的PBS液沖洗，稱取濕重，按200mg組織加入1ml三蒸水的比例，進行組織勻漿，2500r/min離心20min后，取上清液。嚴格按照人神經生長因子ELISA試劑盒(美國博士德生物公司)說明書操作，依照試劑盒說明及標準品濃度，建立標準曲線，每組設置3個復孔。在波長450nm酶標儀(美國 PerkinElmer 公司)上測定A值；以A值為縱坐標，標準品濃度橫坐標，建立標準曲線，根據樣品A值找出對應濃度。

結 果

1.玻璃化保存指固有神經組織結構：HE染色后光鏡下觀察，空白對照組神經鞘膜結構散亂，神經纖維排列疏松、紊亂，局部有脫髓鞘改變；甘油組、丙二醇組神經鞘膜偶見斷裂，神經纖維結構較松散，脫髓鞘改變均較輕；30%DMSO組間神經鞘膜完整性更好，神經脫髓鞘改變更輕；乙二醇組神經鞘膜最完整，神經纖維排列整齊、緊湊，脫髓鞘改變最輕(圖1)。

圖1 玻璃化保存3 周人指固有神經病理切片(HE，×400)A.空白對照組;B.乙二醇組;C.30%DMSO組;D.甘油組;E.丙二醇組

2.玻璃化保存指固有神經生物活性：Calcein-AM/PI雙染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，結果顯示，空白對照組神經纖維綠色熒光(代表活細胞)輕度較弱，紅色熒光(代表死細胞)強度較強，且廣泛分布；實驗組與空白對照組比較，綠色熒光較強，紅色熒光弱；實驗組內，甘油組及丙二醇組神經熒光強度相似，綠色熒光強度最弱，紅色熒光強度最強；30%DMSO組于前兩組比較綠色熒光較強，紅色熒光較弱；乙二醇組綠色熒光最強，紅色熒光最弱，分布范圍有限(圖2)。

圖2 人指固有神經激光掃描共聚焦顯微(Calcein-AM/PI，×400)A.空白對照組;B.乙二醇組;C.30%DMSO組;D.甘油組;E.丙二醇組

3.ELISA法檢測培養神經的神經生長因子(NGF)水平:人指固有神經玻璃化保存3周后，空白對照組NGF(12.95±3.03pg/ml)水平最低，其次是甘油組(61.47±3.34pg/ml)、丙二醇組(62.53±3.64pg/ml)、30%DMSO組(109.51±9.98pg/ml),乙二醇組(112.64±3.54pg/ml)NGF水平最高；空白對照組與4個實驗組間比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)。實驗組間比較，甘油組與丙二醇組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，其余各實驗組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

討 論

周圍神經損傷是創傷外科較為棘手的問題，自體神經移植作為神經損傷修復金標準[2]。受到供區并發癥、取材長度限制、神經直徑匹配度低等限制[3～5]。同種異體神經具有天然的神經結構，提供適合神經再生的基質及生長因子，其來源廣泛、匹配度高，在周圍神經損傷治療中具有優勢[6～8]。

深低溫保存技術能有效地降低異體移植的免疫原性，延長移植神經的時效性。但降溫過程對細胞及組織卻是致命打擊。細胞外冰晶形成導致細胞溶質濃度增高，造成細胞脫水、細胞膜結構及蛋白功能受損，形成“溶質損傷”,細胞內冰晶直接導致細胞死亡[9～11]。玻璃化保存通過高濃度CAPs及超高的冷卻速率，使細胞內外液體形成玻璃態，從而有效避免冰晶形成[12,13]。滲透性CAPs通過提升液體玻璃化轉換溫度及降低溶劑冰點，減少了降溫過程中細胞內外冰晶[14]。解凍過程中滲透性CAPs還可以抑制冰晶再形成導致的二次損傷，進一步保護組織復溫后的組織結構。不同CAPs對組織保護效果存在差異，因其發揮作用的機制不同，DMSO與丙二醇通過改變雙分子層的排列進而起到細胞保護作用，甘油與乙二醇則通過與磷脂分子形成氫鍵發揮保護作用[10，14]。

周圍神經損傷后的再生過程中施萬細胞(schwann cells,SCs)發揮積極作用。損傷后SCs失去軸突支配，成熟的SCs通過基因調控去分化為具有修復狀態的祖細胞，稱為修復施萬細胞[15]。修復施萬細胞引起髓鞘自噬，募集巨噬細胞清除損傷神經斷端周圍的組織碎片，減緩局部炎性反應，為神經軸突再生提供合適環境[16]。同時神經斷端間由巨噬細胞、嗜中性粒細胞、成纖維細胞等形成“神經橋”，SCs沿著神經橋生長形成中控管道，為軸突再生提供支架。SCs生長過程中分泌大量的神經生長因子，營造再生微環境。自體神經移植聯合SCs移植修復神經損傷能有效修復運動功能與感覺功能[17，18]。

根據神經營養因子表達差異，SCs可分為運動型施萬細胞和感覺型施萬細胞，NGF、血管內皮細胞生長因子和胰島素樣生長因子-1在感覺神經施萬細胞中高表達。研究發現，感覺型施萬細胞對運動神經與感覺神經在再生具有較強的引導作用，這是由于NGF的受體TrkA僅在感覺神經中表達引起，所以NGF的濃度水平可以反映誘導感覺神經再生的能力[19]。

周圍神經損傷發生后神經斷端的NGF表達上調后：①促進SCs引起髓鞘自噬，推進髓鞘碎片的清除；②引導SCs沿“神經橋”遷移，協助再生神經支架形成；③為新生軸突提供合適的再生微環境，促進軸突再生；④促進修復施萬細胞的再髓鞘化，由此可見，NGF是神經再生微環境中重要的組成部分。而微環境中較高濃度的NGF可以維持神經的再生狀態[20，21]。人造神經支架由于缺少合適的再生微環境，其修復能力弱于自體神經移植，當加入外源性神經生長因子后神經再生速率與準確性得到明顯提升[22]。研究發現，CAPs可以改變玻璃化凍存的細胞線粒體mRNA的表達，SCs對NGF分泌作用受多種基因信號調控，本實驗中，不同組神經組織勻漿中NGF的含量差別可能與CAPs對SCs活性的保護作用有關，同時不能排除CAPs對SCs內NFG分泌相關基因調控的影響[23,24]。

綜上所述，同種異體神經移植作為理想的修復材料，玻璃化保存可延長使用時限。本實驗結果證實，4種CAPs對人指固有神經的玻璃化法保存均有保護作用，其中乙二醇效果最佳，更適合用于人指固有神經玻璃化保存。本研究旨在為人指固有神經玻璃化保存提供一定的理論基礎，希望后續可以找到更加適合人指固有神經的玻璃化保存方法，為周圍神經損傷再生修復提供新的治療手段。