hsa-miR-20a-3p靶基因預測及生物信息學分析

張 蕊

蘭州大學公共衛(wèi)生學院，甘肅省蘭州市 730000

MicroRNA(miRNA)是由17～22個核苷酸組成且具有高度保守性的小單鏈RNA[1]。miRNAs不翻譯成蛋白質(zhì)，主要通過堿基互補配對的方式與靶基因結(jié)合來抑制其進一步的翻譯表達，或通過RNA誘導直接降解靶標mRNA分子來調(diào)控靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄等方式起調(diào)控作用[2-3]。研究表明miRNAs在腫瘤、免疫性疾病、代謝性疾病、內(nèi)分泌疾病等發(fā)病機制中起重要作用[4]。研究顯示，hsa-miR-20a-3p在皮膚癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用[5-6]。目前對miR-20a-3p的致病分子機制仍有待研究，因此，本研究擬通過對hsa-miR-20a-3p進行生物信息學分析，為其靶點及相關(guān)疾病的致病機理的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-20a-3p保守性分析 在miRbase(http://www.mirbase.org)和UCSC(http://genome.ucsc.ed)等在線數(shù)據(jù)庫查找miR-20a-3p的染色體定位信息及堿基序列，并采用MEGA 7.0軟件對比分析各物種miR-20a-3p序列間的保守性。

1.2 hsa-miR-20a-3p靶基因預測 利用Targetscan(http://www.Targetscan.org)、TarBase(http://microrna.gr/tarbase)、miRDB(http://www.mirdb.org)、miRTarBase(http://www.mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)四大數(shù)據(jù)庫預測hsa-miR-20a-3p的靶基因。用Venny圖法先對miRDB、Targetscan和TarBase 3者預測的靶基因求交集，此外合并miRTarBase數(shù)據(jù)庫中經(jīng)實驗證實的hsa-miR-20a-3p靶基因形成靶基因集合用于后續(xù)分析[7]。

1.3 hsa-miR-20a-3p靶基因的GO功能注釋和KEGG信號通路分析 應用數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8(http://david.abcc.ncifcrf.gov)對hsa-miR-20a-3p的靶基因集合進行GO功能(Gene ontology)注釋分析和KEGG信號通路富集分析。GO功能注釋包括細胞組分、分子功能、生物功能3大應用部分[8]。用Fisher確切概率法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各物種成熟miR-20a-3p序列的保守性分析 結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p基因序列號為MIMAT0004493，聚集于13q31.3染色體區(qū)域中的一個簇內(nèi)，其基因位點在染色體的具體位置為chr13:91351108-91351129。利用數(shù)據(jù)庫miRbase下載Homo sapiens(人)、Capra hircus(山羊)、pteropus alecto(狐蝠)、Cavia porcellus(豚鼠)等10個物種的miR-20a-3p的成熟序列。對比分析發(fā)現(xiàn)miR-20a-3p成熟堿基序列中“acugcauuaugagcacuuaaag”22個堿基在各物種間高度保守，結(jié)果見表1。

表1 不同物種miR-20a-3p成熟序列

2.2 hsa-miR-20a-3p的靶基因預測結(jié)果 利用Targetscan、miRDB和TarBase 3個在線數(shù)據(jù)庫得到靶基因個數(shù)分別為4 387、716和699，通過取交集得到66個靶基因，結(jié)果見圖1a。另外，在miRTarBase數(shù)據(jù)庫中查找經(jīng)實驗證實的靶基因共92個，其中有ADSS和YWHAQ兩個靶基因與上述交集重合，因此得到156個無重復的靶基因集合作為后續(xù)生物分析，結(jié)果見圖1b。

圖1 hsa-miR-20a-3p的預測靶基因個數(shù)

2.3 hsa-miR-20a-3p預測靶基因的GO功能注釋描述 GO功能注釋發(fā)現(xiàn)hsa-miR-20a-3p靶基因集合富集在核漿、細胞質(zhì)、細胞核等9個細胞組分(P<0.05)；富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合等11個分子功能(P<0.05)；富集在前腦形態(tài)發(fā)生、學習或記憶、器官誘導、基因表達調(diào)控等15個生物學過程(P<0.05)，結(jié)果分別見表2～4。

表2 hsa-miR-20a-3p預測靶基因的細胞組分

表3 hsa-miR-20a-3p預測靶基因分子功能

表4 hsa-miR-20a-3p預測靶基因生物學功能

2.4 hsa-miR-20-3p預測靶基因的KEGG信號通路富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p的靶基因顯著富集在病毒致癌、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ(人類T細胞白血病病毒)感染等信號通路中(P<0.05)，結(jié)果見表5。

表5 hsa-miR-20-3p靶基因KEGG信號通路富集分析

3 討論

近年來，hsa-miR-20a-3p在癌癥等多種疾病中的差異表達已得到廣泛研究，miRNA已成為一種多效的致癌或抑癌調(diào)節(jié)因子，作用尚未完全被了解[5-6]。目前也缺乏其潛在靶點和相關(guān)功能通路的全面分析，生物信息學能快速預測miRNA靶基因集合和相關(guān)的生物功能，具有一定的可靠性。本研究通過生物信息學分析方法發(fā)現(xiàn)miR-20a-3p已知的成熟序列在人、獼猴、野豬、錦龜和豚鼠等多個物種間高度保守，表明其可能編碼了與生命活動密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，且可利用在豚鼠等其物種間的保守性序列，將常見的模式生物作為研究miR-20a-3p生物學作用的實驗支持工具；采用目前常用的miRNA靶基因預測方法為使用多種靶基因預測軟件進行預測，為了提高預測結(jié)果的可靠性，利用數(shù)據(jù)庫靶基因交并集來獲取所需研究的靶基因集合，本研究所得無重復hsa-miR-20a-3p靶基因共156個，GO功能分析結(jié)果顯示靶基因主要富集在核漿、細胞質(zhì)和細胞核等9個細胞組分，富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合和損傷DNA結(jié)合等11個分子功能，富集在前腦形態(tài)發(fā)生、學習或記憶、器官誘導、代謝過程調(diào)節(jié)和基因表達調(diào)控等15個生物學過程，KEGG分析結(jié)果顯示hsa-miR-20a-3p的靶基因顯著富集在病毒致癌信號通路、乙型肝炎信號通路和HTLV-Ⅰ感染信號通路中。

已有研究表明miR-20-3p與癌癥具有密切關(guān)系，如miR-20-3p的過表達可調(diào)控靶基因CSNK2A1來促進結(jié)腸癌細胞增殖誘發(fā)結(jié)腸癌[9]，通過調(diào)控CADM1來抑制部分抑癌基因的正常表達來誘發(fā)肺腺癌[10]等來發(fā)揮致癌作用，已成為多種癌癥早期篩查及預后的標志物，并成為癌癥的治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的促血管生成和抗血管生成hsa-miR-20a-3p豐度存在差異，這些患者血管生成受損導致血管并發(fā)癥發(fā)生的潛在機制與其靶向調(diào)控血管生成和脈管系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，且與其他miRNA產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)T2DM病患者中與血管生成有關(guān)的MTDH和PDCD10的兩個基因，參與促血管生成和抗血管生成等不同的生理過程[11]。肝臟中miR-20a-3p表達顯著下調(diào)，可能因為其與c-Myc基因的激活有關(guān)，使其參與了急性缺氧應激調(diào)節(jié)[12]。研究表明miR-20a-3p在胃癌患者機體通常下調(diào)，可與β-連環(huán)蛋白信號通路之間相互作用，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的異常激活在許多惡性腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[13]。miR-20a-3p、miR-21等在研究中被報道與健康長壽相關(guān)，細胞衰老是體內(nèi)固有的腫瘤抑制機制，同時也是與年齡相關(guān)的組織退化和功能障礙的主要驅(qū)動力，相關(guān)的miRNA可能會成為衰老的標志物[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌感染期間，miR-20a-3p呈劑量和時間依賴性增加，其上調(diào)促進了細菌的胞內(nèi)生長，并抑制了結(jié)核分枝桿菌感染的RAW264.7和BMDM細胞中促炎細胞因子的釋放，而miR-20a-3p的下調(diào)具有相反的效果。此外，miR-20a-3p通過直接靶向IKKβ抑制NF-κB通路的活性，從而抑制促炎細胞因子和減弱機體免疫反應，促進結(jié)核分枝桿菌的存活致病[15]。

綜上所述，研究顯示hsa-miR-20-3p所調(diào)控的部分靶基因在生命過程及疾病中的作用是值得進一步的研究和探索，本文預測與其他相關(guān)文獻報道是基本相符的，尤其是病毒致癌過程是值得進一步研究的方向，對臨床治療的新靶點提供理論基礎，靶基因預測結(jié)果有待后續(xù)實驗驗證。