大蔥AfUFGT2 基因的克隆及干旱脅迫下的表達分析

張宇辰 ，徐歡歡 ，王永勤

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心/農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100097；2.長江大學 園藝學院，湖北 荊州 434025）

植物遭受各種非生物脅迫時會積累大量活性氧，從而會導致酶抑制、DNA 損傷，甚至會造成植物細胞死亡[1-2]。黃酮類化合物是植物中主要的次生代謝物，在植物細胞清除活性氧中起到重要作用[3-4]。前人研究表明，黃酮類化合物在植物細胞抵抗非生物脅迫中起到重要作用[5-6]，干旱脅迫下小麥和棗樹的關鍵類黃酮基因的表達水平顯著上調，同時類黃酮化合物含量也顯著增加[7-8]。在擬南芥中過表達AtMYB12能夠導致類黃酮積累，從而提高植物的抗旱性[9-11]。此前的研究已經表明，隨著類黃酮的積累，植物對干旱脅迫的耐受性也不斷增強[12-14]。研究還表明，具有強清除活性氧的黃酮類化合物有助于減輕氧化應激反應，防止植物組織因干旱脅迫而失水[14-16]。

糖基化修飾是黃酮類化合物生物合成途徑中的最后一步，同時黃酮和花青素的穩定性和生物活性是通過調節黃酮糖基化來控制的[17]。到目前為止，擬南芥中編碼糖基轉移酶的基因已經得到了充分的研究[18]。擬南芥中至少有8 種UDP基因被鑒定，盡管這些UDPs基因都編碼糖基轉移酶，但在擬南芥中的功能存在著顯著差異[19-21]。例如，AtUGT78D1特異以UDP 鼠李糖作為糖供體，而AtUGT78D3只能接收對羥基苯甲酸二酯，而不是UDP 葡 萄 糖[19-21]。此 外，作 用 于UGT78D1 和UGT78D2 下游的UGT89C1 參與黃酮醇的二次糖基化。這些研究表明，UGT 與黃酮類化合物的糖基化密切相關[20]。然而，有關參與大蔥（Allium fistulosumL.）中類黃酮糖基化修飾的基因鮮有報道。

本研究從大蔥中分離編碼類黃酮糖基轉移酶的基因AfUFGT2，并利用生物信息學對該基因的結構、編碼蛋白的理化性質進行預測分析；同時對大蔥進行干旱脅迫處理，利用干旱脅迫處理后的植物與對照組AfUFGT2基因的差異表達，預測大蔥類黃酮化合物合成調控研究，旨在為深入研究類黃酮糖基化修飾的分子機制奠定基礎，也為大蔥抗旱品種的選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取北京市農林科學院蔬菜研究中心鞭桿大蔥作為試驗材料。

1.2 大蔥總RNA 的提取和cDNA 合成

總RNA 的提取步驟參照RNAiso Plus（諾唯贊，中國）說明書，提取大蔥的總RNA，稀釋成相同濃度后按照cDNA Amplification（諾唯贊，中國）試劑盒說明書步驟反轉錄成為cDNA，作為實時熒光定量PCR 的模板。

1.3 大蔥UFGT 基因的克隆

根據大蔥RNA-seq 數據庫（NCBI 登錄號：PRJNA827977.）獲 得AfUFGT2基 因 序 列，利 用Primer 6.0 軟件設計引物（表1）擴增AfUFGT2的編碼區序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR 反應體系為樣品cDNA 1 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix10 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共設置35 個循環。PCR 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用pEASY-Blune-Zero 載體將經過純化回收后的電泳產物連接，篩選陽性克隆后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。通過NCBI 對測序得到的AfUFGT2基因編碼區序列進行比對。

1.4 AfUFGT2 基因的生物信息學分析

使用Blast p（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）將AfUFGT2基因進行序列結果分析，使用在線分析工具（https://www.expasy.org/）對AfUFGT2基因編碼蛋白質進行特性預測分析；使用PSORT（https://wolf psort.hgc.jp/）預測AfUFGT2基因編碼蛋白的亞細胞定位；使用DNAMAN 8.0 進行AfUFGT2基因序列的同源性分析；使用MEGA 6.0 軟件進行系統進化樹的構建；使用在線分析工具ExPASy 對AfUFGT2基因編碼蛋白的二級結構進行預測分析；使用在線分析工具SWISS-MODEL對其三級結構進行預測分析并建立同源模型。

1.5 干旱脅迫下的AfUFGT2 基因差異表達分析

選取花蕾期前長勢一致且無病蟲害的30 株大蔥移栽至日光溫室中培養，處理前進行15 d 的預培養，培養條件為白天30 ℃，夜晚18 ℃，每天定時進行人工澆水。把試驗材料分為對照組與干旱組，每組15 株，每5 株作為一個生物學重復。對照組與干旱組均在同一環境下，維持正常的光照以及通風條件，其中干旱組通過停止人工澆水來進行自然消耗，對照組正常進行人工澆水，處理10 d 完成干旱脅迫處理。干旱脅迫處理完成后，分別取假莖和葉放入液氮速凍，提取RNA，并逆轉錄為cDNA。

以大蔥AfTUBA作為內參基因[22]，按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊，中國）說明書步驟在LightCycler480 熒光定量PCR儀（Bio-Rad 公司，美國）上完成反應，實時熒光定量PCR 總反應體系為：10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL、TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 模板1 μL 和ddH2O 7.4 μL。反應條件為95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃50 s，共40 個循環。用2-ΔΔCt計算AfUFGT2基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 大蔥AfUFGT2 基因的克隆與序列分析

以從大蔥葉片中取得的cDNA為模板，通過PCR擴增并進行亞克隆后測序，結果顯示，AfUFGT2基因完整的開放閱讀框長度為1 353 bp，編碼450 個氨基酸（圖1），與數據庫序列對比一致。

圖1 大蔥AfUFGT2 基因序列與氨基酸序列Fig.1 AfUFGT2 gene sequence and amino acid sequence of Welsh onion

2.2 大蔥AfUFGT2 基因的生物信息學分析

使用ProtParam 對AfUFGT2的理化性質進行分析，結果顯示，大蔥AfUFGT2基因編碼的蛋白質分子式為C2159H3399N579O631S16,分子質量為48.08 ku，理論等電點pI 為6.01，不穩定指數為29.03。AfUFGT2編碼蛋白含有48 個帶負電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）和41 個帶正電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），表明AfUFGT2 蛋白穩定性較高。

使用DNAMAN 對大蔥AfUFGT2基因編碼蛋白進行親疏水分析，結果顯示，大部分肽鏈為負值，推斷其為親水蛋白（圖2-A），其中第14 位疏水性最強，預測值為2.156；親水性最強的位點為第156 位，預測值為-2.656。采用NetPhos 對大蔥AfUFGT2基因編碼蛋白進行磷酸化分析，結果表明，其含有7 個Thr 磷 酸 化位點、1 個Tyr 磷酸化位點 和29 個Ser 位 點（圖2-B）。使用Concserved Domain Search 分析AfUFGT2編碼蛋白的蛋白家族歸屬，結果表明，其屬于糖基轉移酶GTB 型蛋白質超家族（圖2-C）。

使用PSORT 對AfUFGT2的亞細胞定位預測發現，其對應的編碼蛋白位于細胞質中。通過SignalP 3.1 和TMHMM 2.0 在線軟件對其進行跨膜區域和信號肽預測分析，結果顯示，AfUFGT2編碼蛋白沒有跨膜區域和信號肽。采用SOPMA 軟件對AfUFGT2基因編碼蛋白進行二級結構構建，結果顯示，AfUFGT2基因的二級結構主要由不規則卷曲（40.87%）、α-螺旋（36.78%）、β-轉角（4.09%）和延伸鏈構成（圖2-D）。三維結構預測顯示，AfUFGT2基因編碼蛋白含有3 個正對的β/α/β類Rossmann 折疊區域（圖2-E）。

圖2 AfUFGT2 基因的生物信息學分析Fig.2 Bioinformatic analysis of AfUFGT2 gene

AfUFGT2 的氨基酸序列與洋蔥（AGN33443）、擬南芥（NP_197207）、矮牽牛（BAA89008）、紫蘇（BAA19659）、秦 艽 三 花（Q96493）、九 眼 獨 活（BAD06514）和三枝九葉草（AID50188）進行多重序列比較結果顯示，大蔥AfUFGT2 氨基酸序列與這些植物的UFGT 蛋白質序列較為相似，保守性數值都較低且具有完整的糖基轉移酶結構域；AfUFGT2 蛋白序列含有PSPG 結構域，且該結構域的第22、23、44 位氨基酸分別為色氨酸、天冬酰胺和組氨酸（圖3）。

圖3 大蔥AfUFGT2 基因序列的多重對比Fig.3 Multiple comparison of AfUFGT2 gene sequences in Welsh onion

進化分析結果表明（圖4），UFGT 同源基因編碼蛋白所構建的進化關系分成兩大分支，其中，大 蔥AfUFGT2與水稻（XP_015635040）、青稞（KAE8797650）等植物所屬類黃酮7-O-糖基轉移酶的氨基酸序列親緣關系相對較遠，與洋蔥AcUFGT1 親緣關系最近，說明AfUFGT2 屬于類黃酮3-O-糖基轉移酶，參與大蔥黃酮類化合物3-O 位置糖基化修飾。

圖4 AfUFGT2 與其他植物UFGT 蛋白的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AfUFGT2 and other plant UFGT proteins

2.3 大蔥AfUFGT2 基因在干旱脅迫下的表達分析

為了了解AfUFGT2基因在干旱脅迫下的表達情況，使用大蔥AfTUBA作內參基因，通過qRT-PCR 對大蔥葉片與假莖中AfUFGT2基因的表達進行分析，結果顯示（圖5），AfUFGT2基因具有明顯的表達特異性，在葉片中的表達高于假莖，在干旱脅迫下大蔥的葉片與假莖中AfUFGT2的表達均顯著高于對照（P<0.05），表明干旱脅迫能夠誘導AfUFGT2基因的表達。

圖5 大蔥AfUFGT2 基因特異性表達分析Fig.5 Analysis of specific expression of AfUFGT2 gene in Welsh onion

3 結論與討論

近年來，類黃酮化合物的生理功能受到了廣泛的關注，這需要大量的UGTs 來修飾類黃酮分子使其發揮作用[23]。盡管這些UGTs 在擬南芥中得到一些研究，但仍有眾多生物學作用等待分析。之前的研究發現，大蔥中的類黃酮化合物含量較高[23]，因此大蔥中的UGTs 對類黃酮含量的調控研究意義重大。次生代謝物——黃酮類化合物在植物抵抗非生物脅迫中起到重要作用，糖基化修飾是黃酮類化合物代謝過程中的重要步驟。糖基轉移酶在植物正常生長過程中起到了重要的作用[24-26]。目前，對糖基轉移酶的研究主要針對植物的脅迫應答。蘋果MdZOG1、大豆GmA02G03420和甜菜BvUGT90A1均受到干旱脅迫的誘導，在干旱條件下顯著上調[27-30]。在玉米的研究中，UFGT2 突變體更容易受到環境脅迫帶來的影響。研究發現，在擬南芥中過表達隨著ZmUFGT2表達量的增加其對干旱和鹽脅迫的耐受性也在不斷增強[17]。在青稞的研究中，一個糖基轉移酶基因HVUL7H11410被鑒定為具有廣譜葡萄糖基轉移酶活性，并介導黃酮糖基化增強抗旱性[30]。有研究表明，PSPG 結構域與酶蛋白的底物識別有關[31-33]。這些研究都表明，糖基轉移酶在植物抵抗干旱脅迫具有重要的作用，能夠通過上調表達，積累類黃酮化合物等生物活性物質，從而緩解干旱脅迫帶來的負面影響。本研究通過大蔥AfUFGT2基因的克隆、生物信息學及實時熒光定量PCR 分析，結果表明，AfUFGT2蛋白序列含有PSPG 結構域，且該結構域的第22、23、44 位氨基酸分別為色氨酸、天冬酰胺和組氨酸，推測AfUFGT2 以UDP-葡萄糖為主要糖基供體，且具有葡萄糖基轉移酶活性。干旱脅迫后AfUFGT2基因的表達量明顯增多，推測可能是因為大蔥為應對干旱脅迫而大量表達AfUFGT2基因，促進黃酮類化合物的3-O-糖基化修飾，從而增加類黃酮基因的表達水平，緩解干旱脅迫。

本研究從大蔥葉片中克隆AfUFGT2基因，生物信息分析表明，AfUFGT2基因編碼一個酸性的親水蛋白，屬于糖基轉移酶GTB 型蛋白質超家族；進化分析表明，AfUFGT2 與洋蔥AcUFGT1 親緣關系最近，屬于類黃酮3-O-糖基轉移酶，參與大蔥黃酮類化合物3-O 位置糖基化修飾。差異表達分析顯示，干旱脅迫下大蔥會通過大量表達AfUFGT2基因來促進類黃酮化合物的生物合成，進而增強植株抵御干旱的能力。這可能是大蔥應對干旱不利環境的一種保護機制。研究結果為深入探究大蔥AfUFGT2基因的生物學功能及抗旱作用機制提供了參考。