小麥組蛋白TaHis3.2 的克隆及鹽脅迫下的表達分析

吳丹萌 ，梁 丹 ，劉 丹 ，張 欣 ，胡子全 ，王志強 ，梁 晨 ，劉一曉 ，潘萍萍 ，王從磊 ，袁卉馥 ，王建賀

（1.河北北方學院，河北 張家口 075000；2.天津市農業科學院 農作物研究所/天津市農作物遺傳育種重點實驗室，天津 300384；3.界首市農業技術推廣中心，安徽 界首 236500；4.天津市寶坻區農業發展服務中心，天津 301800；5.天津市農業發展服務中心，天津 300061）

小麥是我國乃至世界的重要糧食作物[1-2]。隨著對小麥相關育種技術的研究不斷深入和小麥新品種選育及其配套栽培技術不斷應用，我國乃至世界小麥單產已經發展到較高的水平。但是，由于土壤條件及區域生態環境的影響，小麥生產水平存在地域之間及田塊之間的差異，存在超高產田的同時，也存在中低產田，特別是土壤鹽漬化較重的地區，小麥單產較低。近年隨著地下水不斷開采，土壤次生鹽漬化程度也有不斷上升趨勢，據統計，目前有20%的耕地土壤鹽漬化或正在逐步鹽漬化，嚴重限制了小麥產量的進一步提高，形成了大量的小麥中低產田[3]。

作物育種的實踐表明，育種上的突破性進展在于關鍵性基因、關鍵材料的挖掘、研究與利用。如小麥山融3 號通過體細胞融合技術，融入野生近緣種中的染色體片段，提高了其耐鹽性，在0.3%～0.5%的鹽漬化土壤種植，單產達到7 350 kg/hm2。目前，公認的小麥耐鹽品種較少，耐鹽機制研究進展緩慢。同時，由于缺乏與鹽脅迫密切相關基因作用機制研究及分子標記，嚴重制約了耐鹽小麥新品種的選育進程，從而制約著小麥耐鹽性的進一步提高。因此，挖掘小麥耐鹽基因，研究其在鹽脅迫下的信號通路，探明其耐鹽的分子機制，并挖掘優異單倍型，開發分子標記，輔助耐鹽育種，對提升小麥耐鹽育種水平、進一步培育耐鹽性突出的小麥新品種具有重要意義。

研究表明，耐鹽性是一個由多基因控制的農藝性狀[4-7]。目前在擬南芥中明確SOS 信號轉導途徑與耐鹽性密切相關[8-10]。研究發現，SOS 信號轉導途徑主要有2 個方面作用，一是維持細胞內的離子穩態；二是清除鹽脅迫造成的自由基。目前在擬南芥SOS 信號轉導途徑上已經發現6 個重要成員，分別是SOS1、SOS2（AtCIPK24）、SOS3（AtCBL4）、SOS4、SOS5 和SOS6，這6 個成員形成了SOS 途徑的主體網絡[8-10]。同時，小麥中的蛋白磷酸酶信號轉導通路、油菜素內酯信號通路、MAPK 信號通路上的部分基因均能受到鹽脅迫的響應，能夠提升轉基因材料的耐鹽性[3，11-14]。如異源三聚體蛋白磷酸酶的PP2A、PP2C 亞基均受到了鹽脅迫的影響。但是在漫長的進化過程中，植物形成了多種應答鹽脅迫的信號系統，仍然需要通過基因組、轉錄組、生物統計學進行耐鹽基因的挖掘，為耐鹽分子育種提供豐富的優異單倍型及分子標記。

表觀遺傳修飾參與了植物對非生物脅迫的抵御過程，如DNA 的甲基化修飾、染色質重塑以及長鏈非編碼RNA 和小RNA 對下游靶基因的調控，從而影響植物對非生物脅迫的響應。目前，典型的表觀修飾主要是DNA 的甲基化和組蛋白的乙?；?。細胞核中的染色體為高度濃縮狀態，每146 bp 的雙鏈DNA 圍繞組蛋白形成核小體，再濃縮為染色質[15]。其中，核小體為組蛋白八聚體，這些組蛋白由H2A、H2B、H3、H4 構成[16]。組蛋白的編碼基因在真核生物中高度保守，控制著染色質的結構，也影響基因的表達、修復等生物學功能。組蛋白通過表觀修飾，如組蛋白的甲基化、乙?；瘏⑴c基因的表達。目前關于組蛋白家族成員的數目、在染色體上的位置及在非生物脅迫中的作用報道相對較少。前人研究表明，家禽的組蛋白編碼基因約10 個拷貝，哺乳類動物約20 個拷貝，而有的生物則有約上百個拷貝，如海膽中包含600 個組蛋白基因。說明不同物種基因的拷貝數差異較大。而且組蛋白基因成簇存在，如人類的組蛋白編碼位點主要位于6 號染色體，少部分位于1 號染色體；小鼠的組蛋白編碼位點主要位于13 號染色體，少部分位于3 號染色體上。目前關于植物組蛋白編碼成員基因的數量及染色體分布研究的較少。

本研究通過鹽脅迫下轉錄組測序技術，挖掘差異表達基因，重點關注組蛋白成員表達模式變化，最終挖掘到了一個編碼組蛋白的編碼基因His3.2，并在小麥中分離該基因。通過生物信息學分析，明確其保守結構域，并分析小麥組蛋白全家族編碼基因在染色體組上的分布，明確其序列特征，通過reads 數目明確該基因在鹽脅迫的表達模式，初探其功能，并在小麥二倍體祖先種（AA/DD）、四倍體材料（BBAA）、六倍體栽培種（BBAADD）中分離序列，明確克隆序列的來源，通過重測序數據序列分析，初探該基因在不同材料中的變異情況，為探討利用該基因分離單倍型，開發培育耐鹽小麥新品系的分子標記奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所用小麥材料為：祖先種AA01（AA，二倍體，A基因組祖先種）、DD01（DD，二倍體，D 基因組祖先種）、DD02（DD，二倍體，D 基因組祖先種）；四倍體小麥津硬8號（BBAA，四倍體）、kros（BBAA，四倍體）；栽培小麥滄麥14（BBAADD，六倍體冬小麥）、滄6002（BBAADD，六倍體冬小麥）、以色列-1（BBAADD，六倍體冬小麥）、津農6 號（BBAADD，六倍體冬小麥）、遼春10 號（BBAADD，六倍體春小麥）、津強7 號（BBAADD，六倍體春小麥），均由天津市農業科學院農作物研究所保藏。試驗材料具有不同的冬、春性，地理來源不同，親緣關系較遠且在耐鹽、抗旱、抗凍水培上存在較大差異，用于序列分析。

1.2 DNA、RNA 提取及cDNA 第一鏈的合成

在12 h 光 照、12 h 黑暗、22oC 下培養小麥 幼苗至一心一葉期，一部分單株用于DNA 提?。涣硪徊糠诌M行50 mmol/L NaCl 處理1 h，迅速取葉片及根系于2.0 mL 的離心管中，貯存于-80oC 超低溫冰箱中，用于提取RNA。

采用CTAB 法和多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（DP441）分別進行DNA 和RNA 提取，采用thermo 的RevertAid Strand cDNA Sythesis Kit 進 行cDNA 合成。DNA 提取后儲存-20oC 冰箱中，RNA 及cDNA 提取后儲存-80oC 冰箱中，待使用。

1.3 聚合酶鏈式反應

以50 mmol/L NaCl 轉錄組測序挖掘到的與鹽脅迫潛在相關的轉錄本為母序列（query sequence），利用Blastp 對A、D 基因組進行序列比對，找到小麥中His3.2完整序列信息；通過其上下游序列采用Primer premier 5.0 本地軟件設計克隆引物[17]，引物如表1 所示。

表1 基因克隆引物Tab.1 Primer for gene cloning

編碼區及基因分離分別以cDNA 和DNA 為模板進行，采用15 μL 體系進行PCR 擴增。所用高保真酶為TransStart?FastPfu DNA Polymerase（全式金，北京）。

1.4 基因克隆測序

將上述PCR 產物，采用1.2%的瓊脂糖進行凝膠電泳，并對目的條帶進行切膠回收，連接于Blunt載體中(全式金，北京)，通過熱擊法轉入大腸桿菌Top10 中，挑取12 個單克隆進行測序，獲取基因編碼區序列及基因組序列。

1.5 生物信息學分析

采用DNAman 軟件進行核苷酸序列比對；通過HMMER 網站（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）預測氨基酸結構域，采用HMM 算法通過HMMER 軟件進行全家族成員調取，并使用mapchart 進行染色體定位可視化[18]，使用TBtools進行序列統計分析及可視化[19]。通過小麥基因組變異聯合數據庫（http://wheat-cau-edu-cn.vpn.cau.edu.cn:8118/WheatUnion/）進行重測序數據的基因序列分析。

2 結果與分析

2.1 TaHis3.2 基 因cDNA 克 隆

通過保守引物（Ta-4-F/Ta-3-R），在冬小麥津農6 號（BBAADD）的cDNA 中進行擴增，并且連接到克隆載體上，隨機挑取12 個克隆進行測序，結果表明，共分離到2 種核苷酸序列，其長度均為411 bp，2 條序列存在9 個核苷酸的堿基差異（圖1）；2 種核苷酸序列均編碼136 個氨基酸殘基，且氨基酸序列一致率為100%，即2 種序列編碼同樣的氨基酸序列。

圖1 小麥TaHis3.2 核苷酸序列比對Fig.1 Nucleotide sequence alignment of wheat TaHis3.2

經過氨基酸保守結構域分析發現，該基因編碼的氨基酸僅包含一個結構域，為Histon3 結構域（Pfam：PF00125）（圖2）。

圖2 小麥TaHis3.2 結構域Fig.2 Domain of TaHis3.2

2.2 小麥組蛋白全基因組染色體分布

為了進一步研究該家族成員在小麥中的分布情況，明確家族成員數量及染色體分布，依據Histon 保守結構域PF00125 進行小麥組蛋白全家族成員調取，發現該家族存在398 個成員，在小麥的所有染色體上均有分布，且主要分布在染色體的兩端（圖3）；研究表明，該家族成員在六倍體小麥的第1、6、7 同源群上分布較多，分別有70、90、77 個成員，在第2 同源群上分布最少，僅有17 個成員（圖4）；編碼序列分析發現，該家族成員由染色體上的57 390 bp 核苷酸編碼，最長的編碼序列為482 bp，最短的編碼序列僅66 bp（表2）。說明組蛋白家族成員眾多，可能存在功能分化及功能冗余。

表2 小麥組蛋白DNA 編碼序列特征Tab.2 Characteristics of the coding sequence of the wheat histone protein

圖3 小麥組蛋白家族成員在染色體上的分布Fig.3 The wheat chromosomal distribution of histone family members

圖4 小麥組蛋白家族成員在染色體上的分布數目Fig.4 The distribution number of histone family members of wheat on chromosomes

2.3 鹽脅迫下TaHis3.2 表達模式分析

小麥TaHis3.2表達模式如圖5 所示。

圖5 小麥TaHis3.2 表達模式Fig.5 Expression pattern of TaHis3.2 in wheat

為了明確本研究克隆到的TaHis3.2基因表達是否具有組織特異性，是否受到鹽脅迫的影響，本研究具體分析了其表達模式，結果表明，自然狀態下，小麥TaHis3.2主要在根部表達，葉片幾乎探測不到表達，暗示該基因可能主要在根部行使相關功能；鹽脅迫處理下，根部表達受到抑制，葉片探測到的reads 較少（圖5），說明該基因在小麥苗期主要在根部表達，且鹽脅迫抑制該基因的表達。

2.4 TaHis3.2 不同品種間序列特異性分析

通過設計基因組特異引物（Ta-2-F/Ta-1-R），并在二倍體（AA 和DD）、四倍體（BBAA）、六倍體（BBAADD）小麥材料中進行擴增。D 基因組特異引物在沒有D 基因組成分的材料中均無擴增，僅在有D 基因組供體的材料中有擴增（圖6）。同時在多種材料中擴增該基因，基因區未發現核苷酸序列差異，說明D 基因組在不同來源的材料中序列高度保守。

圖6 小麥TaHis3.2 基因D 基因組特異引物不同倍性材料擴增Fig.6 Amplification of TaHis3.2 in genome D by different ploidy materials of specific primers

2.5 TaHis3.2 單倍型及變異頻率分析

為了進一步明確D 基因組上His3.2在自然界中的變異情況，探討該基因的保守性，本研究對667 份小麥重測序數據進行分析，調取該基因的變異信息。發現在667 份來自不同地域的小麥材料中，該基因存在2 種單倍型，單倍型Ⅰ為主要的單倍型，單倍型Ⅱ包含的材料數目少于單倍型Ⅰ（圖7-A）。2 種單倍型在編碼區僅存在一個無義突變，并未導致氨基酸差異（圖7-B）。說明His3.2 在進化上高度保守，也暗示His3.2 具有重要功能，一旦發生氨基酸突變，可能導致植株無法正常生存。

圖7 小麥TaHis3.2 基因D 基因組單倍型Fig.7 Haplotype of TaHis3.2 in D genome

3 結論與討論

小麥作為重要的農作物，耐鹽性水平影響小麥的廣適性，據統計，京津冀區域中的濱海新區、寧河、寶坻、靜海、滄州、衡水、邢臺、唐山等地區含有大量的鹽漬化土壤，其面積達到京津冀總耕地面積的25%，提高這部分鹽漬化區域小麥單產，成為京津冀區域小麥總產量進一步提高的重要途徑。除栽培措施以外，培育篩選耐鹽性突出小麥新種質也是小麥中低產田產量進一步提升關鍵所在。通過耐鹽基因的克隆，挖掘優異耐鹽單倍型，并開發成標記，能夠加速小麥耐鹽育種進程，提升小麥耐鹽水平。因此，轉錄組測序技術、重測序技術被廣泛用于耐鹽基因的挖掘。

本研究通過鹽脅迫下轉錄組測序，結合小麥AA、DD 基因組祖先種供體烏拉爾圖小麥、粗山羊草的基因組測序數據，挖掘到了一個受到鹽脅迫抑制的基因，經過生物信息學分析，該基因含有一個典型的組蛋白保守結構域，初步認定該基因為組蛋白編碼基因TaHis3.2，在六倍體小麥中共分離到2 種編碼序列，其中一條序列來自于D 基因組，通過序列比對發現，該基因在不同基因組上序列一致性較高，具有高度的保守性。前人研究表明，組蛋白為染色體上的重要基因，對維系染色體結構具有重要意義[20-21]。因此，該基因的變異可能會嚴重影響染色體結構，從而影響DNA 的復制，最終影響生物體的各項生命進程。

通過組蛋白保守結構域（PF00125）在中國春基因組中調取該家族全部成員，發現在六倍體小麥中共存在398 個成員，且長短不一。組蛋白在各條染色體上均有分布，在同一個同源群上分布接近。目前，發現組蛋白除了H2A、H2B、H3、H4 外，還有多 種 變 體[22-24]，如H2AZ，當DNA 雙 鏈 斷 裂 時，H2AZ 可能通過改變核小體的穩定性，與核小體重塑復合體部分冗余，并參與轉錄控制，從而維系染色體結構的穩定性，說明組蛋白不同變體具有不同的作用，影響組蛋白修飾等[25-27]。同時，染色體上的多個組蛋白可能具有功能的協同作用，如果1 個組蛋白基因發生突變，功能缺失，其余組蛋白編碼基因可繼續行使相關功能，確保生命體新陳代謝不受過多影響。另外，組蛋白編碼基因也可能是不同組蛋白在不同發育時期、不同組織中起到相關作用，如本研究中克隆的TaHis3.2主要在根部表達，而在葉片中幾乎檢測不到。

鹽脅迫主要導致小麥發育遲緩，生長緩慢，抽穗期晚于對照，株高、根長都受到明顯抑制[28]。本研究發現，組蛋白TaHis3.2的表達受到了鹽脅迫的抑制，表明鹽脅迫影響了組蛋白的表達，可能影響了DNA 的復制，與鹽脅迫抑制植物生長的現象相吻合。本研究克隆的TaHis3.2主要在根部表達，在葉片幾乎探測不到表達水平，根系的發育情況與植物抵御非生物脅迫密切相關，暗示該基因與逆境脅迫密切相關。

本研究設計了D 基因組特異性引物，在六倍體小麥中分離到D 基因組上的TaHis3.2-D基因序列，在親緣關系較遠的小麥材料序列分析中發現，TaHis3.2-D基因序列高度保守，并未發現序列差異。目前，由于D 基因的高度保守性，小麥大部分的單倍型主要發現于B、A 基因組，D 基因組由于變異較小，開發的標記也相對較少。同時，已經公布的基因組重測序數據中，也發現TaHis3.2-D在667 份來自于不同區域的材料中僅存在2 種單倍型，并且編碼同一種氨基酸。由于組蛋白基因功能的重要性[15]，一旦發生變異，可能導致生物體的致死突變，因此，基因的變異頻率本身較少。

組蛋白雖然受到了鹽脅迫的抑制，但是該基因的D 基因組上未發現序列差異，因此，不適合在基因區開發標記進行單倍型研究，用于小麥耐鹽分子育種。在今后的研究中，可以嘗試在該基因的D 基因組的啟動子區域進行SNP 的挖掘，同時設計基因組特異引物區分B、A、D 的表達，明確哪條基因組上的基因與鹽脅迫最相關。同時，利用B、A 基因組上該基因的編碼區及啟動區進行SNP 挖掘，開發相關標記。

本研究重點關注組蛋白編碼基因，利用同源克隆法從小麥中獲得組蛋白編碼基因His3.2，明確其蛋白序列特征TaHis3.2 包含PF00125 保守結構域，通過HMMER 軟件進行全家族調取，發現小麥中該家族共398 個成員，在各個染色體上均有分布，且主要分布在染色體的兩端。表達模式分析顯示，TaHis3.2 主要在根部表達，鹽脅迫抑制該基因的表達。自然群體序列分析發現，在D 基因組該基因高度保守，僅存在2 種單倍型。本研究為挖掘小麥耐鹽相關基因、開發鹽脅迫下的分子標記提供了新的思路。