重組小鼠源MANF 對LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷小鼠轉歸的作用#

汪建文 曾濤 王欣 于洋 萬莉紅 周琰

（1. 四川大學華西醫院重癥醫學科，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理學教研室，四川 成都 610041）

膿毒癥是由各種感染（病毒、細菌）引起的全身炎癥反應綜合征，目前尚無特異性治療藥物，因而病死率高達30%-70%，是重癥監護室患者的主要死因之一[1]。據統計，全球每天約有1.4 萬人死于膿毒癥并發癥，其中膿毒癥急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是最常見的并發癥之一[2]，超過50%的膿毒癥患者出現ALI，且發生ALI后患者死亡率明顯增高。

內質網應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是機體的一種自我保護機制，然而持續的ERS 則會激活凋亡等途徑引起細胞損傷，因此抑制內質網應激可有效減輕膿毒癥患者的病情[3]。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（ Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）是一種新型保守的神經營養因子，主要位于內質網腔[4]，其基因上游啟動子區域中含有內質網應激反應組件-Ⅱ（ER stress response element-Ⅱ，ERSE-Ⅱ），可接受內質網應激相關蛋白ATF6 和XBP-1 的轉錄調節，屬于內質網應激反應基因。研究表明，MANF 在內質網應激時上調或分泌增加，以對抗細胞凋亡發揮細胞保護作用，在膿毒癥心肌細胞凋亡以及腎損傷中均發揮了明顯的保護作用[5-6]。為此，本文擬將MANF 應用于膿毒癥急性肺損傷小鼠探究其保護作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，美國），重組小鼠源MANF（義翹神州科技有限公司，北京），還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（Elabscience）。

1.1.2 動物

6-8 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠（體重20~25 g）購自成都達碩實驗動物有限公司（中國，成都）。所有小鼠飼養于無病原菌的環境（溫度：22～25℃，濕度：55%，光暗循環12：12），可自由攝取食物和水，該動物實驗獲四川大學華西基礎醫學與法醫學院動物倫理審批。

1.2 方法

1.2.1 生存曲線

選取6-8 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠50只，隨機均分為對照組、模型組、MANF 治療組（n=10），適應性喂養3 d 后，模型組和MANF 治療組小鼠以LPS（15 mg?kg-1，i.p.）建立急性肺損傷模型；對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。MANF 治療組小鼠于LPS 注射后6 h 經尾靜脈注射重組小鼠源MANF（250、500、750 μg?kg-1），其余組尾靜脈注射等量生理鹽水；記錄72 h 內小鼠的生存情況，繪制生存曲線。

1.2.2 肺組織病理檢測

選取6-8 周C57BL/6 雄性小鼠24 只，隨機均分為對照組、模型組、MANF 治療組（n=8），適應性喂養3 d 后，采用1.2.1 中方法建立小鼠急性肺損傷模型。MANF 治療組小鼠于LPS 注射后6 h 經尾靜脈注射重組小鼠源MANF（1.2.1 中所得最佳劑量），其余組尾靜脈注射等量生理鹽水。所有小鼠造模24 h 后，腹腔注射戊巴比妥50 mg?kg-1麻醉、心臟穿刺灌注后取左肺組織用4%多聚甲醛4℃固定過夜、包埋并切片，經HE 染色后，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理形態并比較肺組織損傷情況。

1.2.3 TUNEL （ TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色

取包埋后的肺組織切片，采用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）觀察并比較小鼠肺組織凋亡發生情況，使用Hoechst 33258 染料和共聚焦激光熒光顯微鏡對肺組織進行核染色及拍照。

1.2.4 肺組織氧化應激水平測定

取新鮮右肺組織漂洗后加入PBS 進行勻漿，在4℃條件下以10000×g 離心制備組織勻漿，取0.1 mL 待測樣品用PBS 稀釋兩倍后依次按照試劑盒說明加入不同試劑，采用酶標儀分別在405 nm、532 nm 波長測定吸光度并計算還原型谷胱甘肽及丙二醛含量。

1.3 統計學分析

所有數據通過GraphPad Prism 8.0 進行分析，計量資料以均數±標準差（±SD）表示，采用oneway ANOVA 方差分析檢驗；計量資料以率（%）表示，采用卡方檢驗，其中P＜0.05 表示差異具有統計學差異。

2 結果

2.1 重組小鼠源MANF 對LPS 膿毒癥小鼠生存時間的影響

LPS（15 mg?kg-1, i.p.）誘導的膿毒癥急性肺損傷小鼠在LPS 注射后24 h 內死亡明顯，存活率約70%；之后死亡繼續增加，在LPS 注射后72 h僅存活20%；而尾靜脈注射重組小鼠源MANF 750 μg?kg-1后，膿毒癥小鼠24 h 內的病死率明顯降低（P＜0.05），但對長期存活率未見明顯改善（P＞0.05），見圖1。

圖1 生存曲線

2.2 重組小鼠源MANF 對LPS 膿毒癥小鼠肺損傷的保護作用

對照組小鼠肺組織結構完整、排列緊密且無明顯炎性細胞浸潤；LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導的膿毒癥小鼠出現明顯的肺損傷，表現為：肺泡結構損傷、肺泡壁顯著增厚、大量的炎細胞浸潤、可見肺泡內出血；MANF 治療組小鼠肺組織病理變化較LPS 模型組明顯減輕，多數肺泡結構完整、肺泡間隔變窄、炎性細胞浸潤減少，見圖2。

圖2 肺組織病理改變（HE，×200）

2.3 重組小鼠源MANF 對LPS 膿毒癥小鼠肺組織凋亡的影響

與對照組小鼠肺組織相比，LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導的膿毒癥小鼠肺組織TUNEL 陽性細胞占比明顯增加；而與LPS 模型小鼠相比，MANF 治療組小鼠肺組織TUNEL 陽性細胞占比顯著減少，見圖3。

圖3 肺組織凋亡情況（TUNEL 染色，×200）

2.4 重組小鼠源MANF 對LPS 膿毒癥小鼠肺組織氧化應激反應的影響

與對照組小鼠肺組織相比，LPS（15 mg?kg-1）單次腹腔注射誘導的膿毒癥小鼠肺組織GSH水平明顯下降，MANF 治療組小鼠肺組織GSH 水平明顯增加（P＜0.05）；而MDA 水平未見明顯統計學差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 肺組織氧化應激水平（A-GSH；B-MDA）

3 討論

目前大量研究證實MANF 作為一種內質網應激調節蛋白對多種疾病具有保護作用，包括腦缺血、心肌梗塞、視網膜變性等。

本文以膿毒癥肺損傷小鼠為研究對象，采用重組小鼠源MANF 尾靜脈注射的方式，首先觀察了MANF 對膿毒癥病死率的影響，結果發現重組小鼠源MANF（750 μg/kg，尾靜脈注射）對急性期（24 h 內）病死率具有顯著降低作用；然而對長期存活率未見明顯改善。這可能由于我們采用的給藥方式為靜脈注射，而重組MANF 的半衰期較短，單次注射難以長時間維持其恒定的血藥濃度所致。但是，MANF 在膿毒癥急性期內的保護作用是確切的，而急性期正是膿毒癥治療的關鍵時期。

肺是膿毒癥最易受損的靶器官，因此ALI 是膿毒癥最早發生的器官損傷，發生率也較高[7]，早期干預將對膿毒癥患者的肺損傷具有積極的防治價值。本研究選用生存曲線中效果最佳的MANF劑量750 μg/kg 進行試驗，結果通過HE 染色發現MANF 尾靜脈注射對LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷具有顯著的改善作用，不僅明顯減輕了炎性細胞浸潤，同時肺組織結構損傷也有顯著減輕。由于內質網應激在肺損傷中扮演重要的角色，抑制內質網應激可有效減輕膿毒癥患者的病情[3]。在持續的ERS 作用下，肺組織結構細胞在IRE1α 激活X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）轉錄，從而活化下游凋亡蛋白CHOP 的作用下發生凋亡[8]。本文采用TUNEL 染色對肺組織的凋亡情況進行研究，發現MANF 尾靜脈注射可明顯減少LPS 誘導的凋亡，表現為TUNEL 陽性細胞的減少。

另外，持續的內質網應激可調節活性氧（Reactive oxygen species，ROS）激活氧化應激反應，從而消耗細胞內的抗氧化物質谷胱甘肽（Glutathione，GSH）引起細胞內丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量增加[9]。為此，本文通過測定GSH 和MDA 水平間接反映MANF對小鼠肺組織氧化應激反應的影響，結果顯示MANF 治療后明顯增加抗氧化物質GSH 的含量，對MDA 有一定的減輕作用，但缺乏統計學差異，這可能和MANF 半衰期短有關，后期需要進一步加大樣本量以及改變MANF 給藥途徑來進行研究。由于GSH 是肺泡上皮襯液中最主要的小分子抗氧化物質，研究表明GSH 治療后的膿毒癥肺損傷大鼠外周血淋巴細胞凋亡率明顯降低[10]。因此，MANF 治療顯著增加GSH 含量在提高抗氧化應激作用上效果明確。

綜上所述，重組小鼠源MANF 可明顯降低LPS 膿毒癥小鼠急性期病死率；同時對膿毒癥導致的急性肺損傷具有明顯的保護作用，可抑制肺組織凋亡、減輕氧化應激反應。