青島冬春季大氣氣溶膠中抗生素抗性基因組成及影響因子?

賈世杰， 王 嬌，2， 王 欽， 劉曉環，2， 祁建華，2， 高會旺，2??

(1.中國海洋大學環境科學與工程學院， 山東 青島 266100； 2.中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

廣泛存在于氣溶膠中的病原微生物很大程度上存在著抗生素耐藥性甚至多藥耐藥問題，威脅著人類健康[1-2]。世界衛生組織已經將抗生素耐藥問題定義為全球性公共衛生危機[3]。這種抗生素耐藥性問題是由存在于微生物細胞內的抗生素抗性基因(ARGs)導致的。這些ARGs可以在不同微生物間水平轉移，在微生物群落間廣泛傳播，甚至還會導致泛耐藥細菌(即“超級細菌”)的產生。存在于各類環境介質中的ARGs作為一種威脅人類健康的新興污染物，引發了公眾的廣泛關注。氣溶膠作為人類直接接觸的環境，其中的ARGs及其宿主微生物將會通過呼吸作用直接進入人體，影響疾病的治療。

氣溶膠中ARGs的組成受多種因素的影響。霾天等重污染天氣下高濃度的顆粒物會給ARGs及其宿主菌提供更多的附著位點[4]。養殖場和醫院等場所的大氣中通常有著較高的ARGs豐度，這與局地抗生素的大量使用有關[5-6]，隨后這些ARGs會隨著氣流而運輸遷移到其他區域。氣溶膠中的微生物群落往往存在明顯的季節性變化[7]，ARGs也不例外。Xie等[8]發現，北京城市和鄉村冬季氣溶膠中ermB、tetW和qnrS的豐度明顯高于其他季節。風速、相對濕度和溫度是影響氣溶膠中細菌群落的主要氣象因子[9]，而顆粒物粒徑、濃度和化學組分則是影響氣溶膠中細菌群落的主要理化因子[10-11]，這些影響在細菌季節性差異上顯得尤為明顯[12-13]。Ouyang等[14]發現，在雨天ARGs與Cl-、Ca2+、Na+、K+離子和濕度有著較強的相關性。氣象因子和理化因子同樣也可能影響著ARGs的季節性分布，但這些影響尚未明確。

已有研究表明，氣溶膠中ARGs的組成具有一定的地區差異[15]。青島作為一個典型的沿海城市，氣溶膠中ARGs整體上受海陸雙重作用的影響，其東、南瀕臨黃海，既會受到海風對污染物的稀釋，又會受到沿海水產養殖排放的影響；西、北方向是內陸地區，會受到內陸遠距離傳輸的影響。因此，分析青島氣溶膠中ARGs組成及季節差異，探究其影響因子，有助于更全面的認識沿海地區生物氣溶膠的組成，對理解氣溶膠中ARGs的來源及其傳輸機制具有重要的意義。因此，本文于2019—2020年在青島地區采集了冬季和春季大氣氣溶膠樣品，對其中的5類12種ARGs、1種可移動遺傳原件(MGEs)、16S rRNA和化學組分進行了分析，探究了冬春兩季青島氣溶膠中ARGs的組成差異及氣象因子和大氣污染物對其影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地點位于青島市中國海洋大學嶗山校區大氣環境觀測場內(36°09′N，120°29′E)，該采樣點位于青島市東南部，設置在山包上，為局部的最高點，不受建筑物阻擋，氣流交換通暢，無養殖場、醫院等ARGs局地污染源，受人為干擾較弱，因此具有區域代表性。采用2031型大流量總懸浮顆粒物(TSP)采樣器(青島嶗應環境科技有限公司)和Whatman石英濾膜，于2019年12月—2020年5月采集TSP樣品36個(其中冬季樣品13個，春季樣品23個)，每個樣品以1.05 m3/min流量采集約24 h。采樣前將采樣膜于450 ℃灼燒5 h，并用75%酒精擦拭采樣器、濾料架和鑷子進行滅菌，采樣后將樣品立刻保存在-20 ℃冰箱內，直至DNA提取。

1.2 樣品處理與分析

于超凈臺內裁取1/4張樣品膜，加入50 mL PBS緩沖液，4 ℃下300g離心3 h，經0.2 μm PES膜過濾，采用PowerSoil土壤DNA提取試劑盒和AMPure XP磁珠提取過濾得到顆粒物中的DNA[16]。采用NanoPhotometer檢測DNA的純度及濃度后，將合格樣品保存于-20 ℃冷凍保存。

采用博日PCR儀對選定的5類12種ARGs，1類MGEs和16S rRNA基因進行定性檢測，基因名稱、引物序列和退火溫度如表1所示[14,17-22]。將PCR產物克隆到PMD19-T質粒中，并通過DH5α大腸桿菌擴大培養，提取其中的質粒作為qPCR陽性對照，建立標準曲線。采用ABI 7500 qPCR儀進行qPCR定量檢測，總反應系統包括10 μL Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)，0.6 μL Primer-F(10 mmol/L)，0.6 μLPrimer-R(10 mmol/L)，1 μL DNA，0.2 μL BSA和7.5 μL ddH2O。

表1 目的基因的引物信息

1.3 氣象數據和大氣污染物數據來源

通過觀測場內的自動氣象站實時獲取采樣期間的溫度、相對濕度、風向和風速等數據。每小時的AQI、PM10、PM2.5、CO、NO2、SO2以及O3濃度數據來源于青島市環境保護局網站(hbj.qingdao.gov.cn/slairhour.aspx)，具體監測站點為嶗山區子站(36°09′N，120°46′E)。

1.4 數據統計與分析方法

本研究采用SPSS19.0分析不同ARGs亞型間的spearman相關性，以p<0.05作為差異顯著水平；采用RStudio進行冬春季氣溶膠中ARGs的主坐標分析(PCoA)；采用Canoco 4.5進行基于冬春季氣溶膠中ARGs組成和環境因子的冗余分析(RDA)。

2 結果與討論

2.1 冬季和春季氣溶膠中抗生素抗性基因的組成

青島2019年冬季氣溶膠中TSP的濃度為(156.43±82.90) μg/m3，2020年春季為(111.35±38.81) μg/m3，與春季相比，冬季氣溶膠中TSP的濃度更高。ARGs豐度分析結果顯示(見圖1)，氣溶膠中ARGs的組成存在明顯的季節性差異，bla-TEM1、tetW、tetL、sul1、sul3、ermC、ermB在冬季有更高的豐度；bla-CMY2、tetA在春季有更高的豐度，strB在兩個季節差異不明顯，而bla-NDM1和sul2整體豐度較低，只在個別樣品中有檢出(見圖1(a))。青島氣溶膠中ARGs的主導亞型也存在季節差異，冬季氣溶膠中bla-TEM1((1.42×105±1.64×105) copies/m3)豐度最高，其次是tetL((3.41×104±1.38×104) copies/m3)和sul1((2.12×104±2.57×104) copies/m3)；春季氣溶膠中tetL((1.78×104±1.29×104) copies/m3)豐度最高，其次是bla-CMY2((1.66×104±4.42×104) copies/m3)和strB((1.61×104±1.26×104) copies/m3)。整體而言，冬季β-內酰胺類ARGs占比(55.47%)>四環素類ARGs(21.38%)>磺胺類ARGs(8.95%)>大環內酯類ARGs(8.73%)>氨基糖苷類ARGs(5.20%)；春季四環素類ARGs占比(35.93%)>β-內酰胺類ARGs(29.44%)>氨基糖苷類ARGs(17.30%)>大環內酯類ARGs(10.14%)>磺胺類ARGs(7.19%)。β-內酰胺類和四環素類抗性基因是環境中常見的ARGs。在洛杉磯和北京的大氣環境中，bla-TEM1基因也都占據著主導地位[25]。隨著季節的變化，青島地區氣溶膠中的ARGs由β-內酰胺類抗性基因主導逐漸轉變為四環素類抗性基因主導。

圖1 冬季和春季氣溶膠中不同ARGs亞型、intI1、16S rRNA及總ARGs絕對豐度及各ARGs亞型/16S rRNA相對豐度

PCoA分析結果見圖2。其中主成分1的解釋度為39.5%，主成分2的解釋度為22.04%。春季和冬季氣溶膠樣品各自聚類，有較好的分離度，表明這兩個季節的ARGs組成存在較大差異，進一步證實了先前的觀點。整體而言，青島地區氣溶膠中ARGs的組成存在較強的季節性變化。

圖2 冬季和春季基于氣溶膠中ARGs亞型的PCoA分析

值得注意的是，盡管冬季ARGs的污染較重，但intI1和16S rRNA均在春季有著更高的豐度，春季16S rRNA的平均豐度是冬季的20倍(見圖1(a))。Qi等[7]的研究表明，在青島地區，春季氣溶膠中的細菌數量最高，冬季和夏季最低。這意味著春季氣溶膠中有著更高的細菌數量，但其中具有抗生素耐藥性的細菌數量遠少于冬天。ARGs/16S rRNA的相對豐度也證實了這一點，盡管一些ARGs在春季豐度更高，但ARGs相對于16SrRNA的豐度均在冬季更高(見圖1(b))。

冬季氣溶膠中ARGs的總豐度((2.77×105±2.20×105) copies/m3)明顯高于春季((9.28×104±9.76×104) copies/m3)，青島冬季氣溶膠中有著更強的ARGs污染。與此相同，北京地區和土耳其博盧地區氣溶膠中ARGs的豐度均在冬季有最高值(見表2)。冬季氣溶膠中ARGs的高豐度可以歸因于較高的顆粒物濃度和冬季抗生素用藥量的增加。一方面，一些游離在細胞外的ARGs也能夠吸附在顆粒物上，隨氣溶膠的傳播向遠處擴散[26-27]，青島地區氣溶膠中ARGs的總豐度與顆粒物濃度呈顯著相關(r=0.404，p<0.05)。Zhang等[17]對于北京地區氣溶膠中ARGs的研究也表明，隨著顆粒物濃度的增高，ARGs豐度逐漸增加。另一方面，冬季大量的抗生素使用誘導了ARGs的產生。郭倩等[28]的研究證實，溫帶地區溫度較低的冬季流感發病率增加。陳岷等[29]的研究表明，冬季抗菌藥物的使用量高于春季，且冬季β-內酰胺類藥物的使用量最高。整體而言，冬春季青島地區氣溶膠中ARGs的豐度高于北京地區、珠江流域和長江流域同種ARGs的豐度，但低于珠江口春夏季同種ARGs的豐度。因此，不應忽視青島地區氣溶膠中ARGs污染及其對人體健康的危害。

表2 本研究與其他研究中不同季節ARGs豐度

2.2 不同月份氣溶膠中抗生素抗性基因的組成

青島地區氣溶膠中各ARGs存在一定的月變化趨勢(見圖3)。12和1月各ARGs中bla-TEM1占主導，3和5月tetL占主導，而4月則是bla-CMY2占主導。從2019年12月—2020年5月，tetW，tetL和sul3的豐度逐漸下降；bla-TEM1、bla-CMY2、bla-NDM1、sul1、sul2、ermB和strB的豐度在12—3月明顯下降，但在4月有所增加，在5月再次下降，低于3月平均豐度；tetA的豐度變化存在波動，在1月有最高值，在4月出現次高值；ermC的豐度則在1月有最高值，12月有次高值，在3—5月明顯下降。整體而言，除bla-CMY2和strB外的全部ARGs均在冬季出現豐度最大值，bla-CMY2和strB在春季出現豐度最大值。對于總ARGs和intI1而言，其豐度變化趨勢與大部分ARGs相同，在12—3月明顯下降，在4月有所升高，在5月繼續下降。總ARGs豐度最大值出現在12月((3.34×105±2.38×105) copies/m3)，這意味著盡管4月存在較強的ARGs污染，但就整體而言，青島地區冬季氣溶膠中ARGs的污染更重。采樣期間TSP濃度為：12月((161.17±104.78) μg/m3)>1月((150.89±57.01) μg/m3)>4月((118.56±42.62) μg/m3)>3月((108.86±24.81) μg/m3)>5月((91.65±44.71) μg/m3)，這一趨勢與許多ARGs豐度變化趨勢相近。這些ARGs豐度的變化更大程度上受顆粒物濃度的影響，而對于其他ARGs，如tetW、tetL和sul3等，它們的豐度變化受季節性影響更強，更多存在于冬季氣溶膠中，這與抗生素的季節性使用和這些ARGs及其宿主菌對環境因子的響應有關。16S rRNA的豐度在12—5月期間呈明顯遞增趨勢，在5月有最高豐度((2.45×107±2.27×107) copies/m3)，隨著月份的變化，氣溫逐漸升高，整體細菌豐度也隨之增高。

圖3 不同月份氣溶膠中不同ARGs亞型、intI1、16S rRNA及總ARGs豐度

2.3 氣溶膠中抗生素抗性基因間的相關性

為了探究青島地區不同ARGs間的共性，分析不同ARGs在來源和傳輸過程上的潛在共性，對ARGs進行了spearman相關性分析，分析結果見圖4。大部分ARGs間存在顯著正相關關系，其豐度變化趨勢相近，如在12和1月等高顆粒物負荷的情況下，大部分ARGs豐度均增加。tetW、tetL和sul3與其他ARGs間存在相對較弱的正相關關系或無顯著相關性，sul3甚至與一些ARGs存在顯著負相關關系，但這三者之間存在顯著的正相關關系，再次證明了圖3的結果。這三者與其他ARGs不同，受藥物使用等季節性因素的影響大于顆粒物濃度的影響。除此之外，strB與其他ARGs間的正相關性也相對較弱，僅與5種ARGs存在顯著正相關，這意味著strB可能有著與其他ARGs不同的來源或傳輸過程。與此相反，ermB與其他ARGs間的正相關性相對較強，它與除bla-NDM1和sul2以外的9種ARGs間均存在顯著的正相關性(r=0.36～0.81，p<0.05)。在所有ARGs中，bla-NDM1和sul2間存在著最強的正相關關系(r=0.98，p<0.01)，這意味著這兩種ARGs具有一定的共耐藥機制。研究表明，當一些基因位于同一質粒上時，它們通常會出現在同一環境中，而一些存在共現性的ARGs很可能位于相同的質粒上，進而表現出共耐藥機制[31-32]。

(:0.01

2.4 環境因子與氣溶膠中抗生素抗性基因間的關系

溫度、濕度、風速和風向等氣象因子會對氣溶膠中的顆粒物濃度和細菌豐度產生直接影響[33-34]，同時也會對ARGs產生影響。因此，對冬季和春季氣溶膠中ARGs的組成和氣象因子進行了RDA分析(見圖5)。氣象因子對青島地區不同季節氣溶膠中ARGs的組成有著較強的影響。在冬季，風速和溫度是影響氣溶膠中ARGs組成最重要的因素。溫度與sul1、ermB、bla-TEM1、tetW和intI1呈正相關，這些ARGs在低溫天存在更低的豐度，這意味著低溫天青島地區氣溶膠中病原菌對相應抗生素的耐藥性更弱，給人類健康帶來的潛在風險更低(見圖5(a))。風速與bla-CMY2、sul3、strB、sul1和ermB呈正相關。風向與sul1、ermB、bla-TEM1、tetW和intI1正相關。這些與風向、風速相關的ARGs可能來自于較遠的區域，隨著風傳輸到了研究區域。濕度與bla-CMY2、sul3、strB、sul1、ermB、bla-TEM1和intI1呈正相關，這些ARGs在冬季高濕度天對人類健康的潛在風險更高。與冬季相比，春季氣溶膠中ARGs的分布受到溫度和濕度的影響更強，全部ARGs都與濕度呈明顯的負相關關系，春季濕度高的天氣下ARGs對人類健康的潛在風險更低(見圖5(b))。除此之外，溫度對ARGs也存在較強的影響，但僅intI1，bla-NDM1，sul2和bla-CMY2與溫度呈正相關關系，溫度的升高對大部分ARGs及其宿主菌存在不利影響，也降低了這些ARGs的潛在人類健康風險。春季風向與intI1、bla-NDM1、sul2、bla-CMY2和tetA正相關，風速與所有ARGs間均存在負相關，這些與風速、風向相關的ARGs可能有額外的來源。

青島地處北溫帶季風區，且受附近的海洋環境調節，冬季主要受西北風影響，夏季主要受東南風影響。冬季采樣期間青島地區北風頻率較高(27.56%)，其次是西北偏北風(16.67%)和東北偏北風(15.71%)。其中，北風(3.78 m/s)和東北偏北風向(3.21 m/s)的平均風速也相對較高，整體受北風的影響較強(見圖5(c))。青島地區北方是陸地區域，由于工業生產和人類生活的排放，污染相對于東南方向的海洋更為嚴重，北風帶來的顆粒物和ARGs的污染均較強。冬季氣溶膠中strB，tetW，sul3和intI1與風向呈正相關(見圖5(a))，這些ARGs很可能來源于北方陸地區域。而春季采樣期間青島地區東南風頻率較高(20.83%)，其次是東北偏北風(11.41%)和北風(10.14%)，這三個方向的平均風速也相對較高，均超過了3.25 m/s，其中東北偏北風速最高，為4.11 m/s(見圖5(d))。青島地區東南方向是南黃海，海風與陸地風相比更為清潔，可以稀釋陸地氣溶膠中的一些人為源污染物。而春季豐度相對較高的bla-CMY2和tetA則可能是由于采樣地點東南部陸地區域的排放或附近養殖區的逸散而來。并且，春季氣溶膠中bla-NDM1，sul2，bla-CMY2和tetA與風向呈正相關(見圖5(b))，進一步證明了這些ARGs可能來源于采樣點東南部的青島地區生產生活排放和近岸養殖區的排放。此外，對于MGEs，intI1在春季的豐度高于冬季(見圖1)，這意味著春季氣溶膠中ARGs的水平轉移潛力更強。

((a)冬季RDA，(b)春季RDA，(c)冬季風頻和風速，(d)春季風頻和風速。(a)Winter RDA, (b)Spring RDA，(c)Wind frequency and speed in winter，(d)Wind frequency and speed in spring.)

青島地區冬季和春季氣溶膠中ARGs亞型和大氣污染物間的關系具有明顯的差異(見圖6)。冬季氣溶膠中ermB、sul3、tetW、sul1、intI1和bla-TEM1與顆粒物濃度間存在正相關關系，這些顆粒物可以給ARGs及其宿主菌提供附著位點(見圖6(a))。但顆粒物濃度顯然不是影響bla-NDM1、ermC、sul2、tetA和strB的主要影響因素，這些ARGs在冬季呈現出的高豐度可能是由于冬季大量用藥導致的ARGs的額外產生和擴散。氣溶膠中不同粒徑的顆粒物對微生物和ARGs有著不同的富集能力[35]。PM2.5～10對ARGs組成的影響大于PM2.5。除此之外，除O3外的大部分其他污染物與顆粒物有著相似的影響，在高污染情況下，ARGs有更高的潛在人類健康風險。大部分ARGs與AQI間存在正相關關系，但這種關系相對較弱，ARGs在一定程度上會受到空氣污染的影響，但在冬季，這種影響弱于其他污染物。

春季大氣污染物對ARGs的影響與冬季呈現明顯的不同，全部ARGs和intI1均與PM2.5、PM2.5～10、PM10和AQI間呈正相關關系，大部分ARGs與顆粒物間呈強正相關關系，隨著顆粒物濃度的增加，ARGs豐度均明顯上升(見圖6(b))。顆粒物為細菌等微生物和ARGs提供了附著位點，是影響ARGs豐度的重要因素。不同ARGs與不同粒徑顆粒物間的相關關系存在明顯差異，tetL、tetW、ermC和sul3與PM2.5～10相關性更強，而intI1、sul2、bla-NDM1、bla-CMY2和tetA與PM2.5相關性更強。整體而言，與冬季相同，PM2.5～10對氣溶膠中ARGs的組成影響更大。而與冬季不同的是，春季氣溶膠中O3與大部分ARGs間呈更強的負相關關系，在采樣期間，春季O3濃度((113.04±22.66) μg/m3)遠大于冬季((34.46±17.82) μg/m3)，隨著O3濃度的增加，對ARGs的富集逐漸開始產生不利影響。春季氣溶膠中SO2、CO和NO2等氣態污染物與顆粒物依舊有著相似的作用，它們與全部ARGs間均存在正相關關系，這意味著在高污染天，ARGs和氣態污染物對人類健康存在著協同影響，會進一步增強對人類健康的危害。AQI與全部ARGs呈正相關，且這種相關性要比冬天更強，春季空氣污染對ARGs對的影響強于冬季。

圖6 冬季和春季基于氣溶膠中ARGs亞型和大氣污染物的RDA分析

Gong等[36]的研究發現，青島地區總微生物濃度在4.7～7.0 μm和大于7.0 μm時，粒徑分布較高。與微生物的分布趨勢相同，無論是冬季還是春季，青島地區ARGs分布受PM2.5～10的粗顆粒影響強于PM2.5。不同ARGs及其宿主菌傾向于附著在不同粒徑的顆粒物上，對比冬春兩季發現，tetW、ermC、sul3及其宿主菌傾向于吸附在PM2.5～10上，而intI1則與PM2.5有著更強的相關性；其余ARGs在不同季節有著不同的傾向性。

圖7 冬季和春季基于氣溶膠中ARGs亞型和化學組分的RDA分析

3 結語

青島地區冬季污染程度較高，ARGs總豐度和大部分ARGs亞型的豐度均高于春季。冬季和春季氣溶膠中ARGs組成差異明顯，冬季β-內酰胺類抗性基因尤其是bla-TEM1占主導地位，春季四環素類抗性基因尤其是tetL占主導地位。不同ARGs在冬春兩季對溫度和濕度的響應不同，春季濕度對全部ARGs呈抑制作用。ARGs豐度受顆粒物濃度的影響，顆粒物負荷較高的情況下將會存在更高的ARGs污染風險，PM2.5～10比PM2.5對ARGs有更強的富集作用，這一點在春季尤為明顯。青島作為沿海城市，地處海岸區域，冬季青島地區氣溶膠中ARGs主要受北方內陸地區長距離輸送影響，春季則受東南部陸地和近海氣團影響較大。不同ARGs亞型存在不同的潛在來源，整體而言，青島地區氣溶膠中大部分ARGs受土壤揚塵影響較大，其他人為源和河水/海水等水體的散逸同樣可能是一些ARGs的來源。但這些不同來源對青島地區氣溶膠中ARGs的貢獻仍需進一步探究。