超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶及其制品中恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素殘留

張逸雪

（新疆天潤生物科技股份有限公司，烏魯木齊 830002）

奶牛在飼養(yǎng)、產(chǎn)奶過程中，一般需要使用抗生素來預(yù)防和治療奶牛發(fā)病，這些藥物在使用時，在動物體內(nèi)吸收率很低，因此會引起奶牛體內(nèi)、排泄物或牛奶中抗生素殘留［1-4］。雖然合理使用抗生素，有助于促進(jìn)奶牛飼養(yǎng)行業(yè)的發(fā)展，但殘留的抗生素會影響牛奶及其制品的品質(zhì)，長時間食用牛奶及其制品，如鮮牛乳、酸奶、奶片等，還會對人們的健康造成影響［5，6］。現(xiàn)階段，尤其是老人和小孩，牛奶及其制品的食用較為常見，食用抗生素殘留較多的牛奶及其制品，會對老人的健康和小孩的生長發(fā)育造成不良的影響。因此加強(qiáng)對牛奶及其制品中常用抗生素殘留的監(jiān)測，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，關(guān)于牛奶及其制品中抗生素殘留的研究報(bào)道不多，路楊、王麗英、秦振順等研究了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中4 種β-內(nèi)酰胺類抗生素及其主要代謝產(chǎn)物的分析檢測［7］，雍莉、江陽、王艷等研究了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測牛奶中喹諾酮類抗生素殘留的檢測方法［8］，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中GB 29688?2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，GB 29692?2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中喹諾酮類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》。研究報(bào)道主要對象為牛奶，且檢測抗生素的種類單一，不能更好的監(jiān)控牛奶及其制品中抗生素殘留的水平，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，氯霉素采用液質(zhì)法，喹諾酮類藥物，如恩諾沙星，為液相色譜法，與本實(shí)驗(yàn)建立的方法比較，檢測效率較低，且采用液相色譜法專屬性和靈敏度較差。實(shí)驗(yàn)建立一種采用全自動加速溶劑提取法將牛奶及其制品中的恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素提取出來，凝膠凈化色譜法富集、凈化后，上超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀定性、定量檢測的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Agilent 1290 infinity 型超高效液相色譜儀；AB Triple Quad ?4000 型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；ASE 300 型加速溶劑提取儀；Sepaths UP 型全自動固相萃取儀；XS-204 型電子分析天平；Millipore Milli-q academic 型超純水儀；KQ-300GVDA 型臺式超聲波清洗器；MTN-5800 型自動水浴濃縮儀。

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)物編號為BW1355，濃度為100 μg/mL；頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)物編號為A11064800AL，濃度為100 μg/mL；阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)物編號為SB05-100-2008，濃度為100 μg/mL；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)物編號為SB05-093-2008，濃度為100 μg/mL；均購自某生物科技有限公司。甲醇、乙腈試劑：色譜純，外購；甲酸、乙酸銨試劑：分析純，外購；其他試劑：分析純，外購。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

分離柱：Waters Spherisorb ODS1 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm）；色譜柱溫度：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.4 mL/min；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸水溶液（移取1.0 mL 甲酸，加純化水溶解定容至1 L），洗脫程序：0～1 min 89% A，1～4 min 89%～36% A，4～6 min 36%～8% A，6～8 min 8%A，8～8.5 min 8% ～89% A，8.5～11 min 89% A。

1.2.2 質(zhì)譜參數(shù)

開啟三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，過夜抽真空，再用調(diào)諧液調(diào)諧，挑些完畢后，設(shè)定質(zhì)譜參數(shù)。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液

分別取恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，各準(zhǔn)確移取1.0 mL，置4 個棕色容量瓶內(nèi)，加甲醇定容、搖勻，制得恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素濃度均為10 μg/mL 的儲備溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液

取1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，分別準(zhǔn)確移取一定量，置棕色容量瓶中，制備含恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素濃度分別為0.01、0.04、0.1、0.4、1.0、6.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加加甲醇定容、搖勻。

1.3.3 待測溶液制備

液體樣品的前處理：取液體牛奶或牛奶制品，精密稱取20.0 g，置加速溶劑萃取池中，加硅藻土25.0 g，用玻璃棒將樣品與硅藻土拌勻，置全自動加速溶劑萃取儀中，萃取溶劑選擇甲醇-乙腈=2∶1（V∶V），按表2 萃取條件進(jìn)行提取。

固體或半固體樣品的前處理：取固體或半固體牛奶或牛奶制品，粉碎機(jī)粉碎后，精密稱取20.0 g，置加速溶劑萃取池中，加硅藻土25.0 g，混勻后置全自動加速溶劑萃取儀中，萃取溶劑選擇甲醇-乙腈=2∶1（V∶V），按表2 萃取條件進(jìn)行提取。

萃取完畢后，將萃取液取出，置塑料離心管中，低溫離心10 min（轉(zhuǎn)速：6000 R/min），上清液轉(zhuǎn)移至GPC 凈化瓶中，按下列條件進(jìn)行凈化：溶劑：甲醇-乙酸乙酯（V∶V=1∶1），流速：4.0 mL/min，收集100～420 秒的凈化液；取凈化液，準(zhǔn)確移取10 mL，45℃水浴氮吹至近干，加1 mL 甲醇溶解，渦旋，濾過，即得，萃取條件見表2。

表2 加速溶劑萃取條件

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理富集、凈化方法的確定

前處理方法中，待測物從牛奶及其制品中被提取后，因牛奶及其制品基質(zhì)較為復(fù)雜，提取液中共提取物較多，因此需要選擇合適的富集、凈化方法，以期提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。常用的富集、凈化方法有固相萃取法、凝膠凈化色譜法等方法。固相萃取法操作步驟較多，試劑用量大，對環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員造成影響；凝膠凈化色譜法類似于液相色譜分離方法，根據(jù)相似相溶原理，將待測目標(biāo)物從提取液基體中分離出來，凈化效果更佳。依據(jù)現(xiàn)行版國家標(biāo)準(zhǔn)，GB 29688?2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 牛奶中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，優(yōu)化固相萃取條件后，實(shí)驗(yàn)分別選用上述兩種方法，對加標(biāo)濃度為0.1 μg/mL 的加標(biāo)樣品進(jìn)行富集和凈化，結(jié)果選擇凝膠凈化色譜法具有最佳的靈敏度和準(zhǔn)確度。結(jié)果比較見表3。

表3 富集、凈化方法比較

2.2 質(zhì)譜方法的建立

取1.3.1 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用甲醇制備每1 mL溶液中含有恩諾沙星100 ng的檢查溶液，上質(zhì)譜儀檢測，設(shè)定質(zhì)譜掃描模式為全掃描模式，即Q1 Scan，得到恩諾沙星母離子峰；根據(jù)找到的母離子峰，設(shè)定質(zhì)譜掃描模式為產(chǎn)物離子掃描模式，即Product Scan，得到母離子對應(yīng)的產(chǎn)物離子；根據(jù)產(chǎn)物離子的響應(yīng)，選擇響應(yīng)較高的2個產(chǎn)物離子，一個作為定量離子，另一個作為定性離子，根據(jù)選擇的離子對分別進(jìn)行去簇電壓和碰撞動能的優(yōu)化，建立恩諾沙星MRM 監(jiān)測方法。同法建立頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素MRM 監(jiān)測方法。MRM 監(jiān)測方法見表4。

表4 MRM 方法

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、曲線范圍和檢出限

取1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，分別準(zhǔn)確移取一定量，置棕色容量瓶中，制備含恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素濃度分別為0.01、0.04、0.1、0.4、1.0、6.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加加甲醇定容、搖勻；按1.2 方法設(shè)置色譜和質(zhì)譜儀，穩(wěn)定后依次進(jìn)樣上述系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，采集譜圖。以待測物響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)（Y），以待測物濃度作為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信號和噪音比值計(jì)算儀器檢出限；按2.4 方法配制含恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素最終質(zhì)量濃度為0.5 μg/kg 的加標(biāo)溶液，重復(fù)測定7 次，以7 次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限。結(jié)果見表5，譜圖見圖1。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及檢出限

圖1 典型譜圖

2.4 加標(biāo)回收率考察

取牛奶或牛奶制品，分別準(zhǔn)確稱取20.0 g，置加速溶劑萃取池中，再定量加入1.3.1 恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液適量，后續(xù)按1.3.3 方法進(jìn)行后續(xù)處理，制備含恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素最終質(zhì)量濃度依次為0.5、10.0 和300.0 μg/kg 的加標(biāo)檢查溶液，按1.2 方法設(shè)置色譜和質(zhì)譜儀，穩(wěn)定后依次進(jìn)樣上述加標(biāo)檢查溶液，采集譜圖。根據(jù)檢測結(jié)果與加入量折算回收率。結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收率考察結(jié)果

2.5 方法精密度考察

取牛奶或牛奶制品，分別準(zhǔn)確稱取20.0 g，置加速溶劑萃取池中，再定量加入1.3.1 恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液適量，后續(xù)按1.3.3 方法進(jìn)行后續(xù)處理，制備含恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素最終質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL 的精密度檢查溶液，按1.2 方法設(shè)置色譜和質(zhì)譜儀，穩(wěn)定后依次進(jìn)樣上述精密度檢查溶液，采集譜圖。根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算精密度RSD%。結(jié)果見表7。

表7 精密度檢查結(jié)果

2.6 方法應(yīng)用實(shí)例

隨機(jī)購買市售牛奶及其制品樣品，分別按1.3溶液制備方法和GB 29688?2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》國家標(biāo)準(zhǔn)，對樣品進(jìn)行前處理，處理完畢后，按1.2 方法設(shè)置色譜和質(zhì)譜儀，穩(wěn)定后依次進(jìn)樣上述樣品溶液，采集譜圖，計(jì)算樣品中恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素的含量。結(jié)果見表8。

表8 典型樣品結(jié)果

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)建立了采用加速溶劑萃取法將牛奶及其制品中的恩諾沙星、頭孢拉定、阿莫西林和氯霉素萃取出來，凝膠凈化色譜法富集、凈化的前處理方法，超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法定性、定量檢測的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法具有自動化程度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛奶及其制品中常見抗生素殘留的監(jiān)測。