EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達及其與預后的相關性

楊慶軍

喉癌占所有類型癌癥的1%～5%[1]，隨著發病率的增加，喉癌在耳鼻喉科惡性腫瘤中排名第三，占所有耳鼻喉科惡性腫瘤的7.9%～35%，并且90%為鱗狀細胞癌[2-3]。喉癌的發生機制目前仍有待闡明，相關研究表明，表皮生長因子受體(EGFR)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)與腫瘤的發生、侵襲、淋巴結轉移、復發和預后生存率密切相關[4-5]。然而，EGFR和Cyclin D1在喉癌中的相關性及其在喉癌發生發展中是否具有協同作用尚未見報道，研究EGFR和Cyclin D1在喉癌中表達水平的相關性以及與患者臨床特征的關系，有助于闡明喉癌的生物學特征。本研究通過使用免疫組織化學染色和統計分析確定EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達與疾病臨床特征之間的關聯，為評估喉癌的嚴重程度和選擇最合適的治療方案提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年至2019年我院耳鼻喉科手術采集的46例原發性喉鱗狀細胞癌(LSCC)和20例聲帶息肉(VCP)石蠟包埋組織標本，分別作為研究組和對照組。LSCC患者均使用電子喉鏡及病理學檢查確定腫瘤分期，并采用第8版國際喉癌控制淋巴結轉移分期系統(TNM)分期[6]，T1～T2期19例(41.30%)，T3期22例(47.83%)，T4期5例(10.87%)。治療前無頸淋巴結轉移43例(93.48%)，頸部淋巴結轉移3例(6.52%)，均為N1期。治療后復發或轉移28例(60.87%)。所有LSCC患者均行手術治療，包括喉部分切除術、全喉切除術和頸淋巴結清掃術。T4期和部分T3期患者采用鈷-60放射治療或5-氟尿嘧啶+順鉑化療作為輔助治療，所有病例隨訪5年以上。

1.2 免疫組織化學染色方法

使用Super Vision IHC試劑盒(武漢博斯特生物科技有限公司)將標本進行免疫組織化學(IHC)染色。樣品在4 ℃下用4%多聚甲醛固定約24 h，通過分級乙醇脫水，用二甲苯洗滌并包埋在石蠟中。然后5 μm連續切片，在二甲苯和降醇系列中進行常規脫蠟和再水化，并在去離子水中沖洗。內源性過氧化物酶用去離子水中的3%過氧化氫淬滅。用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液在98℃下孵育10 min，然后與10%山羊血清封閉溶液(武漢博士德生物科技有限公司)在室溫下孵育20 min，抗EGFR抗體(OriGene Technologies)，Cyclin D1(福州邁欣生物科技有限公司)在4 ℃下過夜。用PBS洗滌兩次后，將辣根過氧化物酶結合兔抗免疫球蛋白G抗體在37℃中孵育30 min。 3,3'-二氨基聯苯胺染色后，切片在室溫下用蘇木精復染2 min，脫水并貼在蓋玻片上。

1.3 成果評估

細胞核、細胞質或細胞膜中的黃色、棕色及褐色染色為EGFR和Cyclin D1陽性信號。半定量評分分析：隨機選取5個高倍視野(×200)，使用光學顯微鏡觀察各視野計數細胞總數和陽性細胞數，計算陽性細胞百分比。陽性細胞百分比評分：0分：<25%陽性細胞；1分：25%～49%陽性細胞；2分：50%～74%陽性細胞；3分：≥75%陽性細胞。染色強度評分：0分：無顯色；1分：淺黃色；2分：橙色；3分：棕褐色。最后通過上述兩種評分相加獲得最終分數，然后將其除以2。將結果定義為：0分：陰性(-)；0.5～1.0分：弱陽性(+)；1.5～2.0分：陽性(++)；2.5～3.0分：強陽性(+++)。陰性和弱陽性表達定義為低表達；陽性和強陽性表達定義為高表達。評估患者2年總生存率以及EGFR和Cyclin D1表達與患者生存率的關系。

1.4 統計分析

使用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，χ2檢驗分析喉癌患者的性別、年齡、臨床分期、治療后轉移狀況與基因表達的關系。用spearman相關分析基因表達水平之間的關系。采用對數秩檢驗(Log Rank Test)比較各組生存率，并使用Kaplan-Meier曲線進行喉癌患者的生存分析，以評價EGFR和Cyclin D1表達水平與患者生存率的相關性。所有檢驗均為雙尾，以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR和Cyclin D1染色結果

棕色染色的EGFR主要位于喉癌細胞的細胞膜和細胞質中。棕褐色染色的Cyclin D1主要位于喉癌細胞的細胞核中，聲帶息肉組織中EGFR和cyclin D1的表達很低。

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的高表達率分別為71.7%(33/46)和52.2%(24/46)，在聲帶息肉中的高表達率分別為10.0%(2/20)和5.0%(1/20)。喉癌組織和聲帶息肉組織中EGFR和Cyclin D1表達水平差異有統計學意義(χ2=21.332、13.183，P均<0.001)。

2.2 EGFR和Cyclin D1與臨床特征的關系

EGFR和Cyclin D1的表達水平與喉癌臨床分期和治療反應密切相關(P均<0.05)，EGFR和Cyclin D1的表達與患者年齡無關(P>0.05)，見表1。

表1 EGFR、Cyclin D1表達與喉癌臨床特征的關系(例，%)

2.3 喉癌組織中EGFR和Cyclin D1表達的相關性

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達呈正相關(γ=0.356，P=0.015)，見表2。

表2 喉癌組織中EGFR與Cyclin D1的相關性/例

2.4 喉癌臨床特征及組織中EGFR和Cyclin D1的表達與患者生存率的關系

使用Kaplan-Meier曲線進一步分析EGFR和Cyclin D1表達水平與患者生存率的相關性，結果顯示 ，喉癌患者生存率與EGFR(χ2=4.261，P=0.039)和Cyclin D1(χ2=6.219，P=0.013)的表達水平有關，見圖1。

圖1 EGFR和Cyclin D1的表達與患者生存率的相關性

2.5 喉癌患者生存率的COX回歸分析

COX回歸分析表明，治療后復發或轉移與患者較差的生存率密切相關(P<0.001)。較高的TNM分期與患者較差的生存率密切相關，TNMⅠ～Ⅱ 期P=0.001，TNM Ⅲ期P=0.017，TNM Ⅳ期P<0.001。見表3。

表3 喉癌患者生存率的COX回歸分析

3 討論

EGFR是一種配體介導的多功能跨膜糖蛋白，存在于除人體造血系統外的大多數組織的細胞膜上，EGFR對EGF有很高的親和力，這種相互作用具有時間和溫度依賴性、飽和性和可逆性[7]。EGFR激活酪氨酸激酶后，通過RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-PKC-IKK和JAK-STAT通路實現信號轉導的級聯放大，將細胞外有絲分裂信號傳遞到細胞內，從而調節正常細胞生長、分化，并促進細胞損傷修復。EGFR 在許多實體瘤中高度表達，并且與腫瘤進展、細胞凋亡、血管生成和轉移密切相關[8-9]。體外和體內實驗表明，EGFR是喉癌發生發展的重要抗癌靶點，抑制EGFR可以限制喉鱗狀細胞癌的生長，此類藥物在與其他藥物聯合使用時可增強它們的抗癌作用[10-11]。本研究結果表明，與聲帶息肉組織相比，喉癌中EGFR表達顯著增加。此外，在較高TNM分期的組織中發現EGFR表達增加，喉癌治療后復發或轉移的患者中EGFR表達(88.9%)顯著高于未出現復發轉移者(60.7%)，說明EGFR表達可能促進喉癌細胞的侵襲和轉移。

Cyclin D1與CDK4或CDK6相互作用以誘導細胞周期從G1期進展到S期并促進細胞分裂或轉化[12]。Cyclin D1的異常表達可能導致細胞周期失衡，從而導致腫瘤發生[13]。先前的研究證實Cyclin D1與惡性腫瘤的演變密切相關[14]。使用 LSCC異種移植模型的體內研究表明，Cyclin D1下調可以抑制腫瘤細胞生長并誘導細胞凋亡[15]。在本研究中，與聲帶息肉組織相比，喉癌組織中Cyclin D1的表達水平顯著升高。此外，較高的TNM分期與Cyclin D1的高表達相關，喉癌治療后復發或轉移的患者中Cyclin D1的表達(60.0%)較未復發或轉移的患者(29.2%)顯著增加，表明Cyclin D1可能在喉癌的侵襲和轉移中起一定作用。

本研究結果表明，喉癌組織中EGFR和Cyclin D1的表達水平均明顯高于聲帶息肉組織，且與喉癌的TNM分期及治療后的復發轉移密切相關。這兩種因子在喉癌中的表達水平呈正相關，表明EGFR和Cyclin D1可能具有協同作用，該作用的機制可能為EGFR激活RAS/Raf通路，通過MAPK途徑誘導Cyclin D1的表達和激活，從而促進細胞周期進入S期并啟動增殖。然而，有研究表明EGFR和Cyclin D1在喉癌中的表達無明顯相關性[16]，其原因可能是EGFR和Cyclin D1只是參與癌變過程的眾多復雜細胞信號通路的一部分，在喉癌的發生和發展過程中，這些信號通路具有不同的表達階段。用Cox回歸模型對生存率進行分析，發現較高的TNM分期和治療后復發轉移與喉癌患者較差的生存率密切相關。不同TNM分期患者的生存率有顯著差異，提示喉癌的臨床分期和治療反應是影響生存率的獨立危險因素，而EGFR和CyclinD 1高表達是影響生存率的相對危險因素。

綜上所述，EGFR和Cyclin D1的表達水平與患者臨床分期密切相關，其異常表達可能促進喉癌細胞的生長和侵襲，促進腫瘤的復發或轉移，從而影響患者的生存率。臨床上可通過檢測EGFR和Cyclin D1基因的表達來判斷患者生存率，結合特異性靶向EGFR和Cyclin D1基因重組治療可減少腫瘤殘留，防止復發或轉移。本研究的主要局限性是男女比例為45∶1，盡管LSCC在男性中更為普遍，但依舊高于以前的研究[17]。可能是由于單中心的病例數量相對較少造成的，未來應該進行多中心的研究。