天然低共熔溶劑超聲輔助提取羊棲菜多糖工藝優化及其抗氧化性能的研究

◎ 韋華珊，劉凌雯，孔 晶，費玉清，徐 林，陳正件,3,4

（1.珠海中科先進技術研究院生物材料研發中心，廣東 珠海 519000；2.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 523808；3.中科萱嘉醫養（珠海）健康科技有限公司，廣東 珠海 519000；4.珠海萱嘉君行健康產業發展有限公司，廣東 珠海 519000）

羊棲菜（Sargassum fusiforme）是一種藻類植物，又名鹿尾菜、玉海草、六角菜、海大麥藥茶等，隸屬褐藻門墨角藻目馬尾藻科，素有“長壽菜”美譽[1-2]。羊棲菜的整體為黃褐色，包含莖、假根、氣囊和葉片4部分，一般株高30～50 cm，是一種重要的經濟藻類[3]。海洋藻類是海洋中含量和功效最豐富的自然資源，富含多糖、蛋白質、多肽、脂類、氨基酸、膳食纖維和礦物質等活性代謝產物，可用于制作食品添加劑或菜肴，如可用于烹飪蔬菜湯、制備調味品和制作輕食沙拉等，其活性代謝產物已經被廣泛應用在生物醫藥、化妝品和食品等健康領域[4]。

根據相關研究文獻，羊棲菜多糖的提取方法有水提醇沉法[5]、酶提取法[6]、酸提法[7]及超聲波輔助提取[8]等方法，不同提取純化方法和多糖的結構功能密切相關，梁美娜[1]等對羊棲菜多糖的提取工藝進行了系統總結，得知水溶液提取法的羊棲菜多糖得率在4%～10%，酶解提取法羊棲菜多糖得率在8%～19%，超聲波和微波輔助提取羊棲菜多糖的多糖得率在6%～20%。在這些研究中發現，水溶液提取法能很大限度保留多糖的大分子結構，但其對目標多糖無選擇性，雜質較多，加大了后續分離純化的難度。酶解提取法雖然有較好的提取率，但生物酶成本高，不適合大量生產。酸提取法具有較好的提取率，但酸提取法只適合某些多糖的提取，適用范圍窄，除此之外還有調節pH難度較大、過酸易破壞多糖結構等問題。這些方法基本都以水為溶劑，可是水的極性極大，選擇性低，在提取過程中容易把蛋白質、無機鹽等水溶性的成分一同提取出來，會增加后續多糖的分離純化難度。此外，在酸性或者堿性條件下多糖的糖苷鍵較為容易斷裂，導致多糖降解，從而影響多糖的提取效果。研究表明，離子液體（Ionic Liquids，ILs）用于多糖的溶解提取可以簡化提取工藝的流程、縮短提取的時間、提高多糖的提取效率，但是，常規的離子液體在應用中尚存在毒性和生物兼容性不明的問題[9]。因此，研究者提出一種新的試劑叫天然低共熔溶劑（Natural Deep Eutectic Solvent，NADES），NADES是由一定摩爾比的氫鍵供體和氫鍵受體通過氫鍵結合而成的一種物質，因其與離子液體性能相似，故又叫離子液體類似物。NADES性能媲美ILs，與ILs和傳統有機溶劑相比，其制備更加簡單，且具有可生物降解、可回收、成本低的經濟和環保優勢[10-11]。此外，NADES對非極性和極性化合物都具有很強的增溶能力，并對生物活性成分具有較高的提取效率，同時NADES可以溶解大分子物質，因此，將NADES作為提取試劑提取有價值的生物活性成分，在食品、化妝品和制藥行業中具有巨大的發展前景[12]。

本實驗以天然來源的生物堿和有機酸構建了9種NADE提取羊棲菜多糖，為盡可能地保留多糖的活性，提取溫度設定為26 ℃。通過單因素實驗優化羊棲菜多糖的提取工藝，篩選出提取效果最好的NADES、超聲時間、料液比和NADES含水量。將最佳實驗條件下提取的羊棲菜多糖進行抗氧化功效檢測，為羊棲菜多糖的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

左旋肉堿、蘋果酸，上海源葉生物技術有限公司；順丁烯二酸、無水草酸、丙二酸、無水檸檬酸、脯氨酸、丁二酸、酒石酸、葡萄糖和苯酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；濃硫酸、無水乙醇，廣州化學試劑廠。本實驗所采用的試劑為分析純試劑或純度在98%以上，除在實驗中標明之外，均未做任何純化處理。

羊棲菜（浙江食尚農場）、50 mL離心管、50 mL量筒、100 mL容量瓶、100 mL塑料瓶、10 mL圓底離心管、125 mL抽濾瓶、布氏漏斗（內徑80 mm）、玻璃表面皿、40目篩子、96孔板。

本實驗中用到的儀器設備如表1所示。

表1 實驗儀器表

1.2 實驗方法

1.2.1 天然低共熔溶劑的制備

本實驗采用無溶劑酸堿中和法和水相合成方法，避免有機溶劑等有毒物質的使用。采用天然的生物堿和有機酸進行合成制備，將左旋肉堿作為氫鍵受體與9種氫鍵供體（NADES-1：順丁烯二酸；NADES-2：草酸；NADES-3：丙二酸；NADES-4：丙酸；NADES-5：檸檬酸；NADES-6：脯氨酸；NADES-7：蘋果酸；NADES-8：丁二酸；NADES-9：酒石酸）分別按照摩爾比1∶1混合，加入特定質量的去離子水，室溫下攪拌和超聲（40 kHz，30 W）1～5 min，直至形成9種均一、穩定、透明的NADES溶液。

1.2.2 多糖提取

本實驗使用NADES作為提取試劑，通過攪拌和超聲的輔助手段加速提取過程，縮短時間，提高效率；提取完后使用反溶劑法分離回收NADES和多糖的混合物，即多糖的提取物，待檢測多糖含量。

1.2.3 羊棲菜預處理

將羊棲菜用高速萬能粉碎機粉碎，再過40目篩得到羊棲菜粉末。用80%乙醇對羊棲菜粉末進行醇沉，除去原料中的脂質、小分子酯和蛋白質，使粗多糖以沉淀的形式分離出來。按料液比1∶10用80%乙醇處理羊棲菜粉末，磁轉2 h，然后3 000g離心20 min，取沉淀平鋪于玻璃表面皿，放進干燥箱中干燥成粉末，即得到預處理后的羊棲菜原料樣品，可用于后續提取實驗。

1.2.4 羊棲菜多糖提取

稱取1.000 g羊棲菜預處理樣品加入50 mL離心管中，料液比為1∶20，NADES的含水量為40%，超聲30 min。超聲波輔助提取完成后進行離心，調整轉速為3 000 r·min-1，在此轉速下離心10 min，隨后收集上清液于100 mL容量瓶內，繼續向沉淀中加入20 mL去離子水充分洗滌，在3 000 r·min-1的轉速下離心10 min，收集上清液，重復洗滌3次，合并上述4次上清液并用去離子水定容至100 mL，即可得到多糖提取物，先放置4 ℃冰箱暫時保存，待測多糖含量。

1.2.5 單因素實驗

以去離子水為對照組，多糖含量為指標，在9種NADES提取試劑和去離子水中選取具有最優提取效果的NADES，并通過單因素實驗對羊棲菜多糖提取工藝進行優化。主要從超聲時間、料液比和NADES的含水量3個方面進行提取工藝的優化。

超聲時間：固定料液比為1∶20，NADES含水量為40%，探究超聲時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）對提取效果的影響。

料液比：固定NADES含水量為40%，超聲時間為最佳，探究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）對提取效果的影響。

NADES含水量：固定最佳的超聲時間和料液比，探究不同NADES的含水量（10%、20%、30%、40%、50%和60%）對提取效果的影響。

1.2.6 多糖含量的測定

本次實驗檢測多糖含量采用的是苯酚-硫酸法[13]。

配制6%苯酚溶液：稱取6.000 g苯酚，加入去離子水溶解，最后轉移至100 mL容量瓶內，用去離子水定容即可得到6%苯酚溶液。

配制葡萄糖標準溶液：稱取0.200 g葡萄糖，溶于1 L的去離子水中配制成2 mg·mL-1的葡糖糖溶液，再吸取1 mL 2 mg·mL-1葡糖糖溶液，再加入9 mL去離子水配制成0.2 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。

繪制葡萄糖標準曲線：分別吸取葡萄糖標準溶液（0.2 mg·mL-1）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于10 mL試管中，加去離子水至補足體積為2.0 mL，再加6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，再搖勻，隨后室內放置30 min反應，反應結束后吸取200 μL待測液于96孔板中，并于490 nm處測定吸光度。計算加入葡萄糖溶液的濃度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。按上述方法進行多糖含量的測定，可根據葡萄糖標準曲線計算多糖濃度，進而計算多糖含量和多糖的提取率。

1.2.7 羊棲菜多糖抗氧化性能的檢測

因提取的羊棲菜多糖濃度較高，故將提取得到的羊棲菜多糖提取物分別進行5倍和10倍的稀釋，再進行抗氧化性能的檢測。本實驗使用到的抗氧化性能檢測的方法有DPPH自由基清除測試法[14]和ABTS自由基清除測試法[15]。

DPPH是1，1-二苯基-2-三硝基苯肼的簡稱，是一種穩定的自由基，將其溶于乙醇溶液會呈深紫色，并且在517 nm附近有強吸收峰。當有自由基清除劑存在時，DPPH與自由基清除劑的單電子配對而使DPPH乙醇溶液褪色，導致光吸收減弱。因為DPPH乙醇溶液褪色程度與DPPH接受的電子數呈線性關系，可由此評價檢測樣品清除DPPH自由基的能力，從而得到檢測樣品的抗氧化活性。

ABTS法是利用顯色劑ABTS在適當的氧化劑作用下會被氧化成綠色的ABTS+，ABTS自由基在波長734 nm有吸收峰，可在此波長下測定ABTS的吸光度得出樣品的總抗氧化能力。本實驗使用過硫酸鉀（K2S2O8）作為氧化劑與ABTS反應直接生成穩定的陽離子自由基ABTS+，如果加入具有抗氧化性能的物質，則會與ABTS+發生反應，減少綠色的ABTS自由基的含量，從而使反應體系褪色。

式中：A0代表空白對照組吸光度；Ai代表檢測樣品吸光度。

2 結果分析

2.1 羊棲菜多糖提取效果

以去離子水為對照組，多糖含量為指標，在9種NADES提取試劑和去離子水中選取具有最優提取效果的NADES，結果如圖1所示。從中可以看出，NADES-7對羊棲菜的提取效果最佳，提取率達9.39%，比去離子水高2.19%。

2.2 單因素實驗

通過9種NADES和去離子水對羊棲菜多糖的提取效果可知，由左旋肉堿和蘋果酸合成的NADES-7的提取效果最佳，故以NADES-7為提取試劑進行單因素實驗，進一步提高羊棲菜多糖的提取效果，進而優化羊棲菜多糖提取工藝。

2.2.1 超聲時間

在1∶20為料液比，NADES含水量為40%的實驗條件下，探究不同超聲時間對羊棲菜提取效果的影響，結果如圖2所示。在固定料液比和提取試劑含水量的條件下，隨著超聲時間的增加，多糖的提取總體效率趨勢呈現為先增后減，在40 min時達到峰值，故選取最佳超聲時間為40 min。在20 min時其提取效率較10 min下降了0.19%，在誤差范圍內；在40 min之后增加超聲時間提取率反而下降，有可能是超聲導致多糖結構發生改變，影響多糖的提取效果。

2.2.2 料液比

在固定超聲時間40 min，提取試劑的含水量為40%的實驗條件下，探究不同料液比對多糖提取率的影響，結果如圖3所示。從中可以看出，隨著料液比的數值變化，加入的提取試劑逐漸增加，多糖的提取率總體趨勢是上升的，在料液比達到1∶50時提取效率曲線趨于平緩。在圖3中料液比1∶30較1∶20的多糖提取率下降了0.25%，在誤差范圍內，故建議選擇料液比為1∶50。

2.2.3 含水量

作為多糖提取試劑，NADES存在一個問題，其黏度較高，限制了它在提取方面的應用。因此，為了降低黏度，采用不同含水量的NADES進行多糖的提取。不同的含水量會影響NADES的增溶能力以及反應效率，在NADES中加入水，可以調節NADES的黏度以及物理性質。當含水量過低時，NADES具有較高黏度，會阻礙其穿透細胞壁，影響提取效率。當水的含量在合適范圍內，NADES的超分子復雜結構可以得以保留，而進一步稀釋，結構則會被破壞，形成各組分的混合溶液，NADES在稀釋過程中結構的逐漸變化會影響其理化性質和應用。

在固定超聲時間為40 min，料液比為1∶50的實驗條件下，探究不同NADES含水量對羊棲菜多糖提取效果的影響，結果如圖4所示。隨著NADES含水量的增加，NADES-7對羊棲菜多糖的提取效率先增加后減少，在50%出現峰值，提取率為13.82%，因此選擇NADES含水量為50%。在NADES含水量為10%和20%時羊棲菜多糖的提取率相同，可能是NADES黏度較高，對多糖的提取效果無較大的差別。

2.3 羊棲菜多糖抗氧化性能的測定

羊棲菜多糖抗氧化性能如表2所示。從中可以看出，羊棲菜多糖對DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除效率。尤其是在無稀釋的情況下，羊棲菜多糖提取物對DPPH和ABTS自由基的清除率分別高達68.70%和98.89%，遠高于5 μg·mL-1維生素C陽性對照組的43.27%和62.79%。隨著稀釋，羊棲菜多糖提取物的抗氧化性能顯著下降。稀釋5倍時，DPPH和ABTS的清除率分別只有8.47%和60.00%。而當稀釋10倍時，羊棲菜多糖提取物的抗氧化性幾乎可以忽略不記。

表2 DPPH或ABTS自由基的清除率表

3 結論

采用超聲波輔助提取的方法，利用9種生物酸作為氫鍵供體與左旋肉堿作為氫鍵受體合成9種的NADES對羊棲菜進行多糖的提取，考察不同提取試劑提取羊棲菜多糖的效果，并進行單因素優化實驗，考察超聲時間、料液比和NADES的含水量對羊棲菜多糖提取效率的影響，并且后續將提取得到的羊棲菜多糖進行抗氧化性能的測定。結果表明，9種不同NADES對羊棲菜多糖提取具有良好的提取效率，其中由左旋肉堿和蘋果酸合成制備的NADES-7對羊棲菜多糖的提取效果最佳，可達到9.39%。通過單因素實驗得到NADES-7對羊棲菜多糖的最佳提取條件是超聲時間為40 min、料液比為1∶50、NADES含水量為50 %，其提取率可達到13.82%。通過對優化提取工藝后的羊棲菜多糖進行抗氧化性能的測定，發現羊棲菜多糖具有較好的抗氧化性能，其中未進行稀釋的羊棲菜多糖的濃度為0.008 64 g·mL-1，其對DPPH和ABTS自由基的清除率分別達到68.70%和98.89%，較陽性對照維生素C的清除率高1.5倍左右。兩項自由基清除測試均表明提取的羊棲菜多糖具有很好的抗氧化性，由此羊棲菜多糖可以應用到食品、化妝品和生物醫藥等健康領域。