基于HPLC-MS/MS的內標法測定靈芝孢子粉中黃曲霉毒素B1含量的不確定度評定

◎ 陳 云，吳妙姍，崔 平

（安徽工業大學 化學與化工學院，安徽 馬鞍山 243000）

靈芝孢子粉是靈芝生長成熟后從菌蓋彈射出的含有豐富的蛋白質、多糖、三萜、脂肪酸等成分的孢子，具有抗腫瘤細胞、降低血糖、抗氧化等功效[1]。長三角地區的地理環境和氣候易使靈芝孢子粉在生長和儲存過程中發生霉變，產生黃曲霉毒素。黃曲霉毒素主要有黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4種曲霉菌產生的次生代謝物。現階段可以分離鑒定出18種包括B1、B2、M1、M2、G1、G2、Q、P1、H1和GM等[2]，而其中黃曲霉B1是劇毒且最危險的致肝癌物質，常在糧食谷物、油、牛奶、飼料等中檢出[3]。目前薄層色譜法[4]、酶聯免疫吸附法[5]、高效液相法[6]、液相質譜聯用法[7]及氣相質譜聯用法可作為黃曲霉毒素的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝孢子粉（安徽霍山）；黃曲霉毒素B1（AFB1）（2.01±0.05） ng·mL-1；黃曲霉毒素B1同位素內標（13C17-AFB1）（0.501 ng·mL-1），甲醇、乙腈和甲酸銨（色譜純）。

1.2 儀器與設備

Agilent 6460型串聯三重四極桿質譜儀（美國安捷倫）；N-EVAPTM111型氮吹儀（美國Organomation）；CQ-300B-S超聲清洗機（上海躍進器械）；HC-3018R高速離心機（安徽中科）；MS3 digitial渦旋混勻器（德國IKA）；AL204型電子天平（賽多利斯）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準系列溶液配制

AFB1標準品取0.2 mL至10 mL容量瓶中用乙腈定容，配制標準工作液（100 ng·mL-1），然后精確量取50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、600 μL至10 mL容量瓶中，加入100 μL同位素內標液，用初始流動相定容至刻度，配制濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、3.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1，內標濃度均為5.0 ng·mL-1的系列標準溶液。

1.3.2 待測樣品制備

在50 mL離心管中稱樣5 g，加入0.1 mL同位素內標液混勻，加入20.0 mL 90%乙腈溶液，超聲5 min，5 000 r·min-1轉速離心3 min，取4.0 mL上液，加入蒸餾水20 mL，過免疫親和柱凈化，乙腈洗脫，收集凈化液45 ℃氮吹近干，用流動相定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜上機待測。

1.3.3 數學模型確定

根據同位素內標法曲線推算AFB1濃度，計算如下式：

式中：X為試樣中AFB1的含量，μg·kg-1；ρ為樣品溶液在同位素內標曲線中濃度，ng·mL-1；V1為試樣提取體積，mL；V3為凈化后最終體積，mL；1 000為換算系數；V2為凈化時取樣體積，mL；m為稱樣量，g。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱為Aglient SB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相A：5 mmol·L-1甲酸銨水溶液，流動相B：乙腈-甲醇溶液（1∶1），流動相比例為40∶60；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：35 ℃。

（2）質譜條件。方式：多反應檢測MRM；離子源：電噴霧ESI；干燥器溫度：300 ℃；干燥氣流量：11 L·min-1；霧化器壓力：15 psi；掃描方式：正離子，各目標物參數見表1。

表1 質譜離子參數表

2 結果與分析

以AFB1與13C17-AFB1色譜峰面積比為縱坐標，AFB1與13C17-AFB1質量濃度比為橫坐標進行擬合，擬合后回歸方程為Y=1.967 766X+0.002 994，相關系數R2為0.995 3。分析了7份靈芝孢子粉陽性樣品，可計算出7份樣品中AFB1含量分別為2.83 μg·kg-1、2.82 μg·kg-1、2.86 μg·kg-1、2.84 μg·kg-1、2.81 μg·kg-1、2.83 μg·kg-1及2.84 μg·kg-1，均值為2.83 μg·kg-1，相對標準偏差為0.56%。

3 不確定度來源確定

根據試驗的數學模型分析，AFB1的同位素內標法測量結果產生的不確定度主要由稱取樣品質量、樣品處理過程、標準溶液濃度、測量重復性、工作曲線和分析儀器本身6方面組成。

3.1 稱取樣品質量產生的不確定度分量

用電子天平稱量樣品，稱樣量引入的不確定度m=5.000 0 g，天平誤差±0.000 1 g，則

3.2 樣品處理引入的不確定度

樣品加入內標物0.1 mL，定容總體積為20 mL，吸取4 mL上清液凈化后定容至1 mL。根據《實驗室玻璃儀器 單標線吸量管》（GB/T 12808—2015）和《實驗室玻璃儀器 分度吸量管》（GB/T 12807—1991）規定：過程中使用20 mL和1 mL單標吸量管，1 mL和5 mL分度吸量管的允許差分別為±0.030 mL、±0.007 mL、±0.008 mL和±0.025 mL，其相對標準不確定度分別為：

則樣品處理過程中引入的相對標準不確定度可合成為：

3.3 標準溶液濃度的不確定度

3.3.1 標準物質引入的不確定度

使用AFB1濃度是（2.01±0.05） ng·mL-1，提供的不確定度包含因子則相對標準不確定度為

3.3.2 標準溶液配制引入的不確定度

用1 mL分度吸量管移取0.5 mL的AFB1標準物質于10 mL容量瓶（A級）中，得到100 ng·mL-1的AFB1標準工作液。設所有操作過程中溫度一致，體積微量變化不計入，1.0 mL分度吸量管urel(V11)=0.004 6，10 mL容量瓶在《實驗室玻璃儀器 單標線容量瓶》（GB/T 12806—2011）中允許差為±0.020 mL，按三角分布處理：

稀釋重復性容量瓶為0.10 mL，按均勻分布計算：

相對標準不確定度合成為：

3.3.3 分取標準溶液體積不確定度。

配制系列標準溶液時用1 mL A級分度吸量管分取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL AFB1儲備液于10 mL A級容量瓶，再各自加入0.1 mL內標液，定容。其中1 mL的A級分度吸量管使用12次，10 mL A級容量瓶使用6次。因此，系列標準溶液的不確定度為：

相對標準不確定度為：

3.4 測量重復性的不確定度

同一條件下，對同一樣品重復測定7次，結果如表3。

表2 測量結果表

表3 測量結果表

根據分析結果，可計算得樣品AFB1濃度和數據列的標準差s：

則標準和相對標準不確定度計算為：

3.5 工作曲線的變動性分量

擬合后的AFB1標準溶液數據結果表4所示。

線性方程為：Y=1.967 766X+0.002 994，擬合標準曲線殘余標準偏差：

按照下式計算工作曲線的不確定度：

每份樣品和工作曲線溶液各測量1次。

樣品濃度為2.83 ng·mL-1，內標物濃度為5.0 ng·mL-1，故相對標準不確定度為：

3.6 分析儀器的不確定度

操作過程中已包括樣品重復測定和標曲的線性擬合，故檢測分析儀器不再計算不確定度。

3.7 合成不確定度

合成相對標準不確定度為：

則標準不確定度為：

4 擴展不確定度評定

樣品中AFB1的含量為2.83 μg·kg-1，在置信水平95%時，取包含因子k=2，U=0.13×2=0.26 μg·kg-1。靈芝孢子粉中AFB1的含量結果表示為（2.83±0.26）μg·kg-1，k=2。

5 結論

本實驗建立了液相色譜-串聯質譜內標法測定靈芝孢子粉中黃曲霉毒素B1含量的檢測方法，從稱取樣品質量、樣品處理過程、標準溶液濃度、測量重復性、工作曲線及分析儀器本身6方面不確定度的評定發現影響結果的主要因素為標準溶液的配制和標準曲線擬合，因此可通過選擇更加精密的計量器具，增加標準溶液的濃度點及提升操作人員的能力水平等方法來降低不確定度，提高結果的準確性。