液相色譜質譜聯用儀測定動物源性食品中 21種殺菌劑殘留量的方法研究

◎ 湯苗苗，郭良起，張曉莉，孫 晶，侯 賽

（河南廣電計量檢測有限公司，河南 鄭州 450000）

殺菌劑一般是指用于防治由各種病原微生物引起植物病害的農藥。隨著現代殺菌劑的開發和大規模應用，病害對殺菌劑的抗性越來越強，病害的抗性發展要求必須不斷開發殺菌活力更強，殺菌譜更廣的殺菌劑，殺菌劑已成為近年來農藥研發的熱點之一。而隨著殺菌劑的開發及使用，其殘留物可隨著飼料的消耗轉移至動物組織中，繼而可能存在于生乳、動物肌肉等動物源產品中，最終通過食物鏈對人類產生危害。為此，有必要針對動物源性食品中殺菌劑殘留檢測方法進行深入研究，對其殘留量進行監測，以確保消費者的身體健康。

目前，對殺菌劑的研究多為植物源食品及土壤、水體中的殘留，針對動物源食品中各類殺菌劑的殘留研究較少，且對殺菌劑殘留研究也多為常規農藥（有機磷、有機氯及擬除蟲菊酯等）[1-6]。針對目前研發及使用率較高的殺菌劑，如酰胺類殺菌劑（苯并烯氟菌唑、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺和氟吡菌胺）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯）等殺菌劑在動物源性食品中均未見系統研究。本研究采用PSA+C18復合填料凈化結合高效液相色譜 - 串聯質譜（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了同時檢測動物源性食品中21種殺菌劑的檢測方法，可以為相關食品制定國家標準提供技術支持，同時為國家監管相應動物源性食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：從超市/農貿市場購買的牛肉、生牛乳及乳粉，將牛肉樣品勻漿、生牛乳混勻后備用。

試劑：QuEChERS分散萃取填料為安捷倫科技有限公司生產；乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司生產。

21種標準物質：嘧霉胺、2-苯胺基-4,6-二甲基嘧啶-5-羥基（嘧霉胺-5-羥基）、嗪氨靈、丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑、苯醚甲環唑、苯醚甲環唑醇、三唑醇、三唑酮、苯菌酮、苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟吡菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、氟硅唑、丙環唑、吡噻菌胺、咪鮮胺和嘧菌環胺，天津阿爾塔科技有限公司生產。

儀器：Waters TQ-S micro高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀配電噴霧離子源（ESI），美國Waters公司；ME204E/02分析天平，上海梅特勒-拖利多儀器有限公司；CT14RDП臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司；MnltiReax振蕩器，德國Helidolph公司，AS系列超聲波清洗儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10純水機，美國Merck Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備溶液配制

①混合標準儲備溶液。取一定量的標準物質于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1.0 mg·L-1的混合標準儲備液。②混合標準中間液。吸取混合標準儲備液1.0 mL混合于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成0.1 μg·mL-1的混合標準溶液。③基質混合標準工作液。用空白基質溶液配制成0.5～20.0 μg·L-1的混合標準工作液，現用現配。

1.2.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱 溫40 ℃；流 速：0.3 mL·min-1；進樣量：10 μL；流動相A為2 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸），B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，5%B；2～4 min，5%～100%B；4～7 min，100%B；7.0～7.1 min，100%～5%B；7.1～8.0 min，5%B。

質譜條件：電噴霧正離子模式；多反應監測模式（MRM）采集，毛細管電壓2.80 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L·h-1。定性離子對、定量離子對、碰撞能量和錐孔電壓見表1。

表1 21種化合物質譜檢測參數表

續表1

1.2.3 樣品前處理

（1）生牛乳、牛肉。①生牛乳樣品，混合均勻；牛肉樣品勻漿。②分別取5 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩提取，離心分層，轉移上清液，殘留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重復提取，離心后合并上清液備用。

（2）乳粉。①取5 g于50 mL聚乙烯離心管中，加入5 mL水混勻浸泡30 min，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩提取，離心分層，殘留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重復提取，離心后合并上清液備用。②凈化。取2.0 mL提取液于含100 mg C18和100 mg PSA的10 mL離心管中，渦旋1 min，離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.4 方法的準確度和精密度

取牛肉、生牛乳及乳粉5 g，分別添加10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、40 μg·kg-13個濃度水平，按“1.2.3”進行前處理操作，每個濃度進行3個樣本分析，24 h內連續進樣，并與標準曲線同時進行，計算24 h內精密度。

1.2.5 方法適用性

隨機選取市場上生牛乳、純牛奶、乳粉和牛肉各5份，按“1.2.3”進行前處理操作。

2 結果與分析

2.1 方法的準確度和精密度

由表2知，21種殺菌劑的回收率范圍在70.0%～120.0%，精密度均小于10%，說明該方法準確、可靠、重現性好。

表2 方法的精密度和回收率表（n=6）

續表2

2.2 方法的適用性

采用本實驗建立的方法測定了采集市場上生牛乳、純牛奶、乳粉、牛肉各5份，均低于LOQ，檢出率和超出率為0。

2.3 標準曲線和線性范圍

在最低添加回收水平下，以3倍和10倍信噪比結合濃度外推法確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以滿足方法學要求的最低添加濃度作為定量限，在0.5～20.0 μg·L-1線性關系良好，r＞0.995，方法檢出限為0.7 μg·kg-1，方法定量限為2.0 μg·kg-1。滿足《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）的要求。

2.4 樣品提取劑選擇及優化

本研究考察了乙腈、80%乙腈（含0.2%甲酸）、1%甲酸乙腈、0.1%甲酸乙腈和0.2%甲酸乙腈為提取液時對目標物的提取效率。通過加標回收法，在空白基質中加入有代表性的7種殺菌劑混合標準溶液，加標水平均為20 μg·kg-1，靜置24 h后加入20 mL提取液，5種溶液在生牛乳、乳粉、牛肉的提取效率見圖1～圖3。由比對結果知，0.2%甲酸乙腈提取的回收率較高，因此選擇0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑。同時考慮乳粉直接用溶劑提取會出現結塊現象，將奶粉用水浸泡溶解后提取，不再結塊，且提取效果提高約20%。

2.5 凈化方式的比較和選擇

考慮動物源性食品中存在磷脂、蛋白質、脂肪干擾部分化合物分析定量，需要凈化去除干擾。常用的PSA吸附劑為弱陰離子交換填料，能有效去除基質中糖類、脂肪酸等物質；C18吸附劑為硅膠基質鍵合十八烷基填料，具有比表面積大、吸附能力強等優點，能夠較好除去脂類、脂肪等非極性物質的干擾。選擇PSA、C18、PSA和C18復合、Oasis PRiME HLB柱凈化，以監測磷脂信息比較凈化效果，最終選擇PSA+C18（1+1）復合凈化方式。

2.6 基質效應的影響與校正

用不同的基質按照前處理方法凈化后得到的上清液配制標準溶液為基質匹配標準溶液，用溶劑配制的標準溶液作為溶劑標準溶液，通過測定該21種殺菌劑在各基質匹配標準溶液中校正曲線的斜率（A）及其在純溶劑標準溶液中校正曲線的斜率（B），得到基質效應（Matrix Effect，ME），ME=（A-B）/B×100%。根據文獻[6-7]的研究，當-50%≤ME＜-20%或20%＜ME≤50%時，為中等程度的基質干擾效應；當ME＜-50%或ME＞50%，表示基質干擾程度強烈。

21種殺菌劑基質效應如圖4所示，結果表明，不同農藥基質效應不同，同種農藥在不同基質中基質效應也不同，大部分干擾為中等或者強烈程度，因此基質標準溶液定量非常重要。

3 結論

本項目建立了一種同時檢測動物源性食品中21種殺菌劑的檢測方法，該方法具有安全高效、快速準確、易實現自動化等特點，對目標化合物的加標回收率達到70%～120%，24 h內精密度和穩定性測試RSD≤10%，方法重現性高，且檢出限能滿足國家標準中對牛肉、生牛乳及乳粉中殺菌劑限量的最低要求。