菌酶協同作用制備鰱魚鮮味劑分析

◎ 任 濤，余 薇，羅 茜，劉 婷，潘篤杰

（武漢工控工業技術研究院有限公司，湖北 武漢 430019）

水產品味道鮮美，因其不但具有高蛋白、高度不飽和脂肪酸、微量元素和維生素等營養成分，而且還具有游離氨基酸、牛磺酸、琥珀酸、核苷酸、肌肽、鵝肌肽、甜菜堿及氧化三甲胺等具有特殊風味的呈味物質[1]。

生物體組織細胞中存在著各種消化酶，在控制條件下，它們能對細胞內蛋白質、多糖、脂肪等大分子進行分解，尤其是這種多酶自溶體系通過激活可以將蛋白質分解為氨基酸和肽類，從而改變原料的物理化學結構和營養成分組成，進一步影響其風味和質構[2-7]。米曲霉能夠分泌多種水解酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶等，廣泛應用于發酵食品工藝中。耐鹽酵母，也被稱為“營養酵母”，具有繁殖快、酶系豐富、不產毒素等優點[8-9]。

本文在對當前控制酶解及自然發酵制備鮮味劑工藝研究的基礎上，以鰱魚為原料，利用魚體內源酶系對原料進行預水解，通過米曲霉和耐鹽酵母共發酵過程分泌的酶系催化原料成分，多級轉化制備水產鮮味劑，對制備的鰱魚鮮味劑理化和感官指標進行了定性、定量分析，以期能夠為水產品綜合深加工提供一條新途徑，對調味品行業新產品開發提供參考，為該產品的工業化應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉、耐鹽酵母，湖北省工業微生物菌種保藏與研究中心篩選保藏；鰱魚、香菇柄、食鹽，市售；其他試劑均為分析純。

PL2002型電子分析天平，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；PHS-25型實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；WEF.M6/16馬弗爐，沃爾福（上海）實業有限公司；膠體磨，天水骨泥機廠；DV-C粘度計，Brookfield公司；SPME萃取裝置：SPME手柄；萃取頭；氣質聯用儀：7890A/5975C（Agilent）；頂空采樣瓶：20 mL（Agilent）；氨基酸自動分析儀，日立 L8800；等離子體發射光譜儀，熱電iCAP6300；原子吸收光譜儀，日立Z5000；自動蛋白質分析儀，熱電FLASH 4000 N；發酵罐，NBS。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌酶協同作用制備鰱魚鮮味劑的工藝條件

（1）原料準備。鮮活白鰱魚三去（去頭、去腮、去內臟）后清洗干凈，超低溫粉碎成魚糜冷藏待用。香菇柄烘干后，超微粉碎至60～80目待用。定量分析魚糜水分、蛋白質、脂肪、灰分和揮發性風味成分。

（2）內源酶預酶解。冷藏的魚糜用0.5 mol·L-1NaOH調節pH值至9.0，55 ℃酶解1 h，監測內源酶處理過程中體系總揮發性鹽基氮（Total Volatile Basic-Nitrogen，TVB-N）、游離氨基態氮、黏度的變化。

（3）發酵。調整酶解液中香菇柄粉含量為20%，NaCl含量2%，115 ℃滅菌10 min。將擴培后的混合菌株（米曲霉∶耐鹽酵母=1∶2）接種到發酵培養基中，調節pH和發酵溫度，間歇攪拌培養。基本發酵參數：混菌接種量3%，pH值為6.0，溫度32 ℃，共發酵120 h。

（4）自溶。調整發酵液NaCl含量至5%，溫度60 ℃以促進菌體裂解釋放胞內核苷酸、谷胱甘肽、B族維生素等多種成分。

（5）滅菌并低度熱反應。自溶后的反應液升溫至105 ℃并維持10 min。在此過程中原料中各種代謝產物之間發生輕度美拉德反應，使得產品質地均一、香味柔和本真。定量分析產品營養成分、揮發性成分、氨基酸組成、重金屬含量和衛生指標。

1.2.2 檢測方法水分的測定根據《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）；灰分的測定根據《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）；蛋白質含量測定根據《食品安全國家標準 食品中蛋白

質的測定》（GB 5009.5—2016）；脂肪含量測定根據《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）；氨基酸態氮含量測定根據《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009.235—2016）；砷含量的測定根據《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》（GB 5009.11—2014）；鉛含量的測定根據《食品安全國家標準 食品中鉛的測定》（GB 5009.12—2017）；鎘含量的測定根據《食品安全國家標準 食品中鎘的測定》（GB 5009.15—2014）；汞含量的測定根據《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》（GB 5009.17—2021）；揮發性鹽基氮的測定的測定根據《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》（GB 5009.228—2016）；氨基酸組成分析參照《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124—2016）；呈味核苷酸二鈉測定參照《雞精調味品》（SB/T 10371—2003）；微生物檢測：GB4789系列；揮發性成分分析：固相微萃取（Solid Phase Micro-Extraction，SPME）結合氣質聯用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）。

2 結果與分析

2.1 內源酶酶解前后魚糜TVB-N和氨基酸態氮含量的對比分析

初始鰱魚的TVB-N值為14.25 mg/100 g，氨基酸態氮含量為18.5 mg/100 g，黏度為5 156 cp，3 h時內源酶水解液的TVB-N值為27.7 mg/100 g，黏度為418 cp，此時氨基酸態氮含量為131.3 mg/100 g。進一步延長內源酶解時間，游離氨基酸態氮含量無顯著變化，而TVB-N值逐漸升高，這是因為隨著內源酶活性降低，來自原料及開放體系的腐敗菌快速增殖，分解蛋白質生成氨、二甲胺、三甲胺等揮發性含氮化合物。這些成分的存在會嚴重影響水解液的感官特性，因此控制內源酶水解過程的TVB-N值低于30 mg/100 g。此外內源酶水解會顯著降低反應體系的黏度，有利于增強設備利用率和降低工序能耗便于工業化生產。

2.2 原料及產品營養成分分析

通過表1和表2可以看出，鰱魚經內源酶預酶解、發酵、自溶、滅菌并低度熱反應處理后得到的鮮味劑產品蛋白質含量高，脂肪及氯化物含量低，總氨基酸含量在18.82%。氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量占氨基酸總含量的36.2%，必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量之比（EAA/NEAA）為0.57，接近FAO/WHO標準規定的0.4和0.6。此外還含有肌肽、γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA）和豐富的鈣質。

表1 原料與產品成分表

表2 鮮味劑氨基酸組成分析表

2.3 原料和產品中揮發性風味化合物比較分析

鰱魚肉中揮發性風味成分經氣相色譜-質譜聯用儀40 min內即能完全解析，解析出的成分以揮發性羰基化合物和醇類為主，也含有少量的酯類和硫醚類化合物。研究發現，新鮮鰱魚魚肉中的氣味活性物質主要有己醛、庚醛、戊醇、辛醛和(Z)-2-戊烯-1-醇等烯醇、烯酮、烯醛類化合物，如六碳化合物己醛可以產生一種明顯的原生味、鮮香類植物香和醛的特征香味，8個碳原子的揮發性醇和羰基化合物能產生特殊的類似植物的新鮮香氣，9個碳原子的化合物(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛和3,6-壬二烯-1-醇是新鮮魚類中類黃瓜香和類蜜瓜香的來源[10-12]。

本次實驗檢出此類化合物相對百分含量高達55.42%。在用鰱魚制備鮮味劑的過程中，其經過菌酶協同作用、菌體自溶和輕度美拉德反應后，其揮發性羰基化合物和醇類的相對百分含量降低至5.53%，雜環類化合物含量顯著增加，可能是經美拉德和熱解反應生成的，其中2-芐基（苯甲基）異氰化含量高達66.19%，有典型香氣[13-15]。總體來說，與鮮味劑氣味相關的化合物多為六碳至九碳化合物、含氮類物質[16-19]，且相對分子質量分布范圍主要在80～200，這些化合物通過協同增效構成了鰱魚鮮味劑獨特滋味和氣味。原料和產品中揮發性成分的種類及相對含量具體見表3。

表3 原料和產品中揮發性成分的種類及相對含量比較分析表

2.4 產品中呈味物質分析

一般呈味氨基酸主要包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸和脯氨酸，從表1數據可看出本產品中呈味氨基酸占游離氨基酸總量的55.68%。谷氨酸鈉的呈味閾值為0.012 g·kg-1，而天門冬氨酸鈉的呈味閾值0.01 g·kg-1，本產品中谷氨酸、天門冬氨酸的含量分別為3.02%和1.74%，為主要的呈鮮味物質，而鳥氨酸的呈味閾值為0.012 g·kg-1，肌苷酸二鈉的呈味閾值為0.025 g·kg-1[20]，本產品中I+G的含量為0.166%。谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉與I+G的協同增效作用極大地提升了產品的鮮度。

2.5 產品重金屬含量和衛生指標分析

鮮味劑中重金屬砷、鉛、鎘和汞的含量分別為0.036 g·kg-1、0.005 g·kg-1、0.001 g·kg-1、0.029 g·kg-1，均遠低于《食品安全國家標準 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中規定的砷1.0 g·kg-1、鎘0.1 g·kg-1、汞0.1 g·kg-1的限量。鮮味劑中菌落總數＜10 CFU/100 g，大腸桿菌數＜30 MPN/100 g，遠低于《食品安全國家標準 水產調味品》（GB 10133—2014）中規定的菌落總數和大腸桿菌限量要求。

3 結論

以鰱魚為原料，通過菌酶協同作用聯合輕度美拉德反應技術制備鮮味劑，對產品進行了綜合分析，可以得出如下結論：與目前的酶解法和自然發酵法生產過程相比，本工藝省去了大量商品酶的使用，極大地降低了成本，全部生產時間僅130 h，提高了生產效率。產品呈味化合物含量豐富，谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉與I+G的總含量高達4.926%，揮發性化合物中2-芐基（苯甲基）異氰化含量高達66.19%；產品營養素全面，鈣質含量為1.9%，富含18種氨基酸，其中EAA/NEAA值為0.57；產品衛生安全，重金屬含量遠低于《食品安全國家標準 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中的限量要求，菌落總數、大腸菌群及致病菌含量符合《食品安全國家標準 水產調味品》（GB 10133—2014）規定要求，是一種營養、安全的魚制調味品。