木瓜酶促進大鼠血管內皮細胞成血管的功能研究

楊淑瑩 吳國鋒

廣州市荔灣中心醫院腎內科，廣州 510170

維持性血液透析治療（maintenance hemodialysis，MHD）的基本支持是擁有一條良好的血管通路，是患者賴以生存的生命線［1］。自體動靜脈內瘺（arterio venous fistula，AVF）是目前MHD 患者中首選的血管通路，其在維持透析時所占血管通路的目標比例大于80%［2］，具有使用時間長、安全性高、并發癥少等優勢［3］。然而，由于AVF 頻繁的穿刺使用，不可避免地出現內瘺狹窄、血栓形成、瘺管疼痛等，直接影響到內瘺的使用壽命及透析的質量［4-6］。臨床中廣泛采用未成熟的番木瓜去籽瓢切片與高濃度白酒密封浸泡2 周以上，在AVF 穿刺24 h 后進行濕敷的護理措施［7］。馬偉平和胡綺雯［8］研究結果顯示：木瓜酒濕敷AVF 能改善瘺管狹窄、血流量不足效果顯著。木瓜酶主要存在于番木瓜的莖葉和果實中，是活性較高的蛋白水解酶［9-11］。木瓜酶在食品、工業、醫藥等領域中得到了廣泛的應用。其中在中醫學領域中具有疏通經絡、活血化瘀、抗凝、抗氧化、抗血栓、抑菌抗炎及促進組織修復等作用［12］。但其促進組織修復機制，目前尚不明確。因此我們推測，木瓜酶可能對組織中血管組織形成具有促進的作用。

材料與方法

1、細胞培養

采用大鼠血管內皮細胞（EPC）（中科院上海細胞庫），以1×104每孔接種于6 孔培養板，每孔加入2 ml 含10%FBS（ThermoFisher，美國）的 DMEM 培養基（ThermoFisher，美國），設置 4 組，分別為空白對照組，含10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml 木瓜酶（Aladin，中國）的完全培養基。24 h 后更換為相應培養基，培養14 d。

2、VEGF（血管內皮生長因子）及CD31（血小板-內皮細胞粘附分子）表達水平檢測

將6 孔板中的細胞用預冷的PBS 清洗3 次，除去培養基和其他雜質。每孔加入Trizol（Takara，日本）裂解液1 ml，吹打混勻2 min。將吹打后的混合液轉移至1 ml 的EP 管中（不立即提取RNA 則轉入-80 ℃冰箱備用）。每個EP 管的混合液中加入200 μl三氯甲烷（廣州化學試劑廠，中國），震蕩15 s，待混合液呈乳濁液后置于冰上靜置15 min。待混合液分層后，轉入低溫離心機（Eppendorf，德國），12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心15 min。離心后小心吸取400 μl上清液，轉移到新的EP管中，加入500 μl異丙醇（廣州化學試劑廠，中國），顛倒混勻10 s，冰上靜置10 min，12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心10 min，此時可見EP 管底部有白色RNA 沉淀。棄去上清，在沉淀中加入75%乙醇1 ml，震蕩，7 500 r/min，4 ℃離心5 min，去上清。在沉淀中加入無水乙醇1 ml，震蕩，7 500 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃離心5 min，去上清。將EP 管倒置于濾紙上，風干8～10 min。在沉淀中加入15 μl的DEPC處理水（ThermoFisher，美國），吹打，充分溶解后檢測 RNA 濃度。將 RNA 稀釋至 1 000 ng/μl，置于冰上備用每個樣本按說明書體積混合，轉移入200 μl 的EP管，吹打均勻。 將 EP 管離心，放入常規 PCR 儀（ThermoFisher，美國），調制程序并運行。將EP 管取出，吹打混合均勻。將EP 管離心，放入常規PCR 儀，調制程序并運行。逆轉錄完成后，將樣本取出放入-20 ℃冰箱備用。設計反應板，將96 孔板置于冰上，每個反應孔按照說明書加入逆轉錄試劑盒（Takara，日本）各種試劑。用封閉膜將96 孔板封閉，2 000 r/min 離心2 min，離心半徑10 cm。將板放入CFX96 熒光定量PCR 儀（Bio Rad，美國）的反應模塊，調制程序并運行。運行結束后，記錄數據。

3、EPC增殖活性檢測

在96孔板中接種各組細胞（1×103個/孔），加入適量培養液定容為100 μl，接種3板，以24 h、48 h、72 h為時間點，放入37 ℃恒溫培養箱中（5%CO2，飽和濕度）。在每個時間點取出96孔板，每孔加入10 μl的CCK-8溶液。將96孔板用錫箔紙遮光處理，重新放入培養箱中，孵育2 h。取出96孔板，將板放入酶標儀中，檢測450 nm吸光度值，記錄數據。

4、統計學處理

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，用（）表示，多組間比較采用方差分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）結果顯示，在培養7 d、14 d 后，添加木瓜酶組的 EPC VEGF 及 CD31 表達水平顯著高于空白對照組，且隨著木瓜酶濃度升高，其表達亦隨之升高。在0 d、7 d、14 d 時間點VEGF 表達水平，較之空白對照組：10 μg/ml 組表達倍率為1.04、1.56、2.14，50 μg/ml 組為1.02、2.42、3.28，100 μg/ml 組為1.01、2.02、3.05；50 μg/ml顯著高于 10 μg/ml 組，100 μg/ml 組較 50 μg/ml 組無顯著升高（圖1A）。在0 d、7 d、14 d 時間點CD31 表達水平較之空白對照組：10 μg/ml 組表達倍率為1.03、1.60、2.02，50 μg/ml組 為 1.02、2.22、3.65，100 μg/ml 組 為 1.01、2.66、3.66；CD31 表達水平隨著木瓜酶濃度升高而逐漸升高（圖1B）。CCK-8 顯示，EPC 的增殖能力隨培養基中木瓜酶濃度升高而升高。在 0 d、7 d、14 d 時間點，10 μg/ml 組增殖活性為108%、117%、126%，50 μg/ml 組為 103%、123%、121%，100 μg/ml組為104%、138%、142%（圖2）。

圖1 4組大鼠血管內皮細胞成血管相關因子VEGF（A）和CD31（B）表達水平

圖2 4組大鼠血管內皮細胞增殖活性

討 論

木瓜酒濕敷是當前臨床護理工作者對透析患者廣泛使用的護理干預措施，其能夠有效地減少AVF因反復的穿刺導致的局部的炎癥因子激活，產生氧化反應、血管內皮功能紊亂［13］。木瓜作為中醫常用藥材，具有活血化瘀，促進愈合的功效。當前臨床使用木瓜酒多為患者自行制作，其護理效果、質量統一性參差不齊。木瓜酶是木瓜中主要的生物活性成分，已廣泛應用于食品，制藥工業。其生物安全性、生物相容性已得到廣泛證實［14］。木瓜酶具有消炎、溶栓、促進組織修復的功能。近年來，多項研究表明木瓜酶可能是木瓜酒濕敷療法中發揮功效的活性因子［15-16］。然而，對于木瓜酶在該療法中的功效、作用機制以及功效與用量關系等方面，目前尚欠缺相關研究。因此，如何定量分析木瓜酶對創口愈合及血管形成的作用，以及分析木瓜酶促血管形成，創口愈合的作用機理，是當前亟待解決的問題。本研究通過采用添加木瓜酶的完全培養基對EPC進行培養，檢測EPC成血管分化水平及增殖水平。EPC為大鼠主動脈內皮細胞，是實驗室常用研究血管形成的細胞。木瓜酶為水溶性蛋白酶，能夠溶解于常規培養液中。結果表明，木瓜酶可有效促進EPC成血管分化，且對細胞增殖水平具有促進作用。本研究在常規培養液中添加木瓜酶，通過木瓜酶與細胞直接作用，檢測EPC成血管分化相關指標及增殖水平。VEGF和CD31為血管內皮形成的標志性因子，其表達水平可在一定程度上反映出細胞內皮向分化的水平［17］。實驗結果表明培養液中木瓜酶濃度在10 μg/ml和50 μg/ml時，能夠顯著提高成血管分化相關因子VEGF 表達，當木瓜酶濃度達到100 μg/ml時，其成血管分化水平及增殖水平無顯著上升。表明該濃度下木瓜酶對VEGF作用無明顯提高。而CD31的表達水平隨培養液中木瓜酶濃度升高而呈上升趨勢。此外，EPC細胞增殖活性亦隨木瓜酶濃度提高而增加。因此，本研究結果表明，木瓜酶能夠在體外促進EPC的成血管向分化及細胞增殖。然而，如何獲得促進EPC成血管向分化的木瓜酶最優濃度，木瓜酶通過何種機制促進成血管分化及細胞增殖，在體內模型中是否發揮同樣的功效，仍有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突