紅芪精準煮散飲片HPLC指紋圖譜建立及3種指標成分測定

李 碩，俱蓉，楊秀娟，趙林華，仝小林*

紅芪精準煮散飲片HPLC指紋圖譜建立及3種指標成分測定

李 碩1, 2, 3，俱蓉1，楊秀娟1，趙林華4，仝小林4*

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730000 4. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

建立紅芪精準煮散飲片高效液相色譜指紋圖譜和3種指標成分的含量測定方法。采用HPLC法測定紅芪飲片與紅芪精準煮散飲片中芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量，色譜柱為Robusta C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為254 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。建立了紅芪精準煮散飲片的特征指紋圖譜，并指認出了20個共有峰中的3個主要峰芒柄花苷（峰11）、毛蕊異黃酮（峰13）和芒柄花素（峰16），3種成分在各自范圍內線性關系良好（≥0.999 5），平均加樣回收率98.08%～99.33%，RSD在1.46%～2.37%。通過加權得分，比較紅芪精準煮散飲片與傳統飲片中3種成分，得到紅芪精準煮散飲片1.00 g約相當于傳統飲片 1.37 g。建立的指紋圖譜及含量測定方法可為紅芪精準煮散飲片的質量控制與評價提供依據。

紅芪；精準煮散飲片；HPLC；指紋圖譜；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；芒柄花素；質量評價

紅芪是豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪Hand. -Mazz.的干燥根[1]，因其根皮為紅棕色而得名，最早記載于《神農本草經》[2]。其性微溫、味甘，歸肺、脾經，具有補氣升陽、利水消腫、生津養血等功效，主要成分有黃酮類、皂苷類、生物堿類、氨基酸類、有機酸類、甾醇、多糖、微量元素等[3-5]，藥理作用有提高免疫能力、強心利尿、抗自由基、抗病毒等[6-7]。

“煮散”一詞最早見于唐代孫思邈的《備急千金要方》。中藥煮散指原藥材或飲片經加工粉碎成適當的粗顆粒，用時用水煮后去渣取汁而得到的液體制劑。煮散既保留了湯方特色，而較之湯劑，在提高藥物有效成分的煎出率、節省藥材、降低成本等方面具有極大的優越性[8-11]。臨床實踐證實，中藥煮散的療效確切，且具有用藥量少、所用原料的體積小、便于攜帶及服用等諸多的優點，在臨床上具有廣闊的應用前景。

精準煮散飲片，其實質是通過標準化和規范化工藝，將中藥飲片的形狀規格微小化、均勻化處理，使飲片批量規模穩定化、批內質量均一化，實現準確、高效的自動化分裝、調劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的穩定有效[10]。基于此，本課題組圍繞紅芪精準煮散飲片的研制及質量控制展開系列研究，確定了紅芪精準煮散飲片的最佳粒度為0.200～0.400 cm。

中藥指紋圖譜是一種多指標的質量控制模式，對紅芪精準煮散飲片進行指紋圖譜研究及指標性成分含量測定，能夠更加有效體現飲片的整體品質及綜合質量[12-17]。本研究采用HPLC法對10批紅芪精準煮散飲片進行指紋圖譜研究及相似度評價，并測定紅芪指標成分芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量，得到精準煮散飲片與傳統飲片“量”的對應關系，為紅芪精準煮散飲片的質量控制及開發利用提供參考依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

紅芪飲片，批號200801、200802、200803、200804、200805、200901、200902、200903、200904、200905，均來自甘肅康樂藥業有限責任公司，產于甘肅隴南，經甘肅中醫藥大學李成義教授鑒定為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪Hand. -Mazz.的干燥根。

紅芪精準煮散飲片的制備：取紅芪飲片制備為0.200～0.400 cm（5～10目）的煮散顆粒，備用。批號200801、200802、200803、200804、200805、200901、200902、200903、200904、200905的紅芪飲片分別對應精準煮散飲片S1～S10。

樣品通過四分法選取，保證樣品具有代表性。

1.2 試劑

對照品芒柄花苷（批號P03A10F84910）、芒柄花素（批號H06S9Z69494）、毛蕊異黃酮（批號Y05J11H115098），質量分數均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純），磷酸（分析純），天津大茂化學試劑廠；水，飲用純凈水，596 mL，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 儀器

LC-20型高效液相色譜儀、DAD檢測器，日本島津公司；BSA224S-CW型電子天平、CPA224D型十萬分之一電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；KQ500VDE型超聲波清潔器，昆山市超聲儀器有限公司；WF-300 CH-300型粗碎機，江陰市高宏機械制造有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Robusta C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～25 min，19%～44%乙腈；25～45 min，44%乙腈；45～45.01 min，44%～19%乙腈；45.01～50 min，19%乙腈；檢測波長為254 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品適量，加甲醇分別制成質量濃度為960.1、145.5、620.5 μg/mL的對照品溶液。然后再分別吸取1.00 mL定容到100 mL棕色量瓶中制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取紅芪精準煮散飲片1.000 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率250 W、頻率40 kHz）提取40 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液。用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即為供試品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學驗證

2.4.1 精密度考察 精密吸取S1樣品的供試品溶液20 μL，按照上述色譜條件連續進樣6次，記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件進行相似度分析，以芒柄花苷峰為參照，多點校正后全峰匹配，結果表明，6個供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.993、0.991、0.995、0.991、0.993、0.991，說明該方法精密度較好。

2.4.2 重復性考察 取同一樣品（S1），照“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件進行相似度分析，以芒柄花苷峰為參照，多點校正后全峰匹配，結果表明，6個供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.997、0.998、0.996、0.997、0.996、0.992，說明本方法重復性良好。

2.4.3 穩定性考察 取同一樣品（S1）溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進樣，按上述色譜條件記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件進行相似度分析，以芒柄花苷峰為參照，多點校正后全峰匹配，結果表明，6個供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.993、0.992、0.992、0.996、0.991、0.991，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 指紋圖譜及技術參數

2.5.1 不同批次紅芪精準煮散飲片指紋圖譜的建立及特征指紋峰的標定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析來自10個不同批次的紅芪精準煮散飲片，所得10批紅芪精準煮散飲片HPLC指紋圖譜見圖1。將10批紅芪精準煮散飲片的HPLC數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件，生成藥材的對照指紋圖譜及共有模式，確定20個共有特征峰。通過與對照品溶液色譜圖對比，確定其中11號為芒柄花苷，13號為毛蕊異黃酮，16號為芒柄花素，具體見圖2。

2.5.2 不同批次紅芪精準煮散飲片指紋圖譜相似度評價 高效液相指紋圖譜可獲得樣品的整體信息，通過圖譜比較，可反映樣品與樣品之間的親疏程度。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件，對來自10個不同批次的紅芪精準煮散飲片進行相似度評價分析。結果（表1）顯示，相似度均在97%以上，表明不同批次樣品之間具有較高的相似性。

2.6 含量測定

2.6.1 線性關系考察 精密吸取“2.2”項混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別用甲醇稀釋至10 mL，得不同質量濃度梯度的混合對照品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰峰面積，以峰面積積分值為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（）進行線性回歸，得回歸方程分別為芒柄花苷＝8 849 769.642 9＋ 53 684.066 7，＝0.999 7，線性范圍48.0～384.0 μg/mL；毛蕊異黃酮＝6 925 924.360 4－ 20 334.783 5，＝0.999 5，線性范圍7.3～58.2 μg/mL；芒柄花素＝7 619 655.299 5＋17 250.133 3，＝0.999 9，線性范圍31.0～248.2 μg/mL；結果表明，3種成分在各自質量濃度范圍內線性關系良好。

圖1 10批紅芪精準煮散飲片HPLC指紋圖譜

11-芒柄花苷 13-毛蕊異黃酮 16-芒柄花素

表1 10批紅芪精準煮散飲片指紋圖譜相似度評價

Table 1 Similarity evaluation of fingerprints of 10 batches of Hedysari Radix precision boiled powder decoction pieces

編號相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照 S11.0000.9930.9910.9950.9880.9880.9970.9950.9810.9910.996 S20.9931.0000.9960.9940.9970.9930.9920.9880.9940.9950.998 S30.9910.9961.0000.9980.9950.9980.9930.9850.9940.9970.998 S40.9950.9940.9981.0000.9910.9960.9960.9890.9890.9960.998 S50.9880.9970.9950.9911.0000.9930.9890.9850.9940.990.996 S60.9880.9930.9980.9960.9931.0000.9930.9820.9930.9950.997 S70.9970.9920.9930.9960.9890.9931.0000.9950.9820.9920.997 S80.9950.9880.9850.9890.9850.9820.9951.0000.9720.9820.991 S90.9810.9940.9940.9890.9940.9930.9820.9721.0000.9940.993 S100.9910.9950.9970.9960.9900.9950.9920.9820.9941.0000.997

2.6.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，得到芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD分別為0.84%、1.02%、0.59%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取S1樣品，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄化素的含量，結果芒柄花苷平均質量分數為59.40 μg/g，RSD為3.33%；毛蕊異黃酮平均質量分數為18.80 μg/g，RSD為2.90%；芒柄化素平均質量分數為213.93 μg/g，RSD為0.48%，結果表明該方法重復性良好。

2.6.4 穩定性試驗 取同一樣品（S1）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在制備后在0、2、4、10、16、24 h進行測定，記錄峰面積，結果芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積RSD分別為3.15%、1.89%、1.99%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.5 加樣回收率試驗 稱取已測定3個成分含量的樣品（S1）6份，每份0.50 g，精密稱定，分別加入與樣品中含量相同的芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，得芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄化素的平均加樣回收率分別為99.33%、98.08%、98.18%，RSD分別為1.46%、2.37%、1.80%。

2.6.6 樣品含量測定 取紅芪飲片和紅芪精準煮散飲片，按取“2.3”項下制備供試品溶液，依照“2.1”項下色譜條件測定，計算紅芪飲片和紅芪精準煮散飲片中芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，結果顯示，10批次紅芪精準煮散飲片中芒柄花苷、毛毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均質量分數分別為85.18、25.02、290.57 μg/g，較紅芪飲片中3種指標成分平均質量分數分別高出39.78%、42.97%、36.04%，結果見表2。

表2 紅芪精準煮散飲片和紅芪飲片中芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量

Table 2 Content of ononin, calycosin and formononetin in Hedysari Radix precision boiled powder decoction pieces and Hedysarum polybotrys decoction pieces

紅芪飲片質量分數/(μg?g?1)紅芪精準煮散飲片質量分數/(μg?g?1) 芒柄花苷毛蕊異黃酮芒柄花素芒柄花苷毛蕊異黃酮芒柄花素 20080160.6618.14212.50S183.6729.03288.75 20080260.7818.23215.00S286.1622.49293.75 20080361.4716.57213.75S384.2425.29290.00 20080461.1616.54213.75S485.6025.42290.83 20080560.3415.98210.90S585.4424.29289.58 20090160.6916.79214.76S685.8725.28285.76 20090260.7118.93213.64S784.3025.09290.40 20090361.3218.74213.79S884.4625.14290.53 20090461.7318.35215.28S986.8323.57292.67 20090560.5416.72212.55S1085.1924.59293.41 平均值60.9417.50213.59平均值85.1825.02290.57

2.7 獨立性加權分析

獨立性權重法數據之間相關性，使用回歸分析得到復相關系數（），該值越大表明共線性越強，則權重越低。以芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄化素含量為評價指標，進行加權評分，3種成分的權重見表3。取10批樣品3種成分的平均值進行綜合評分，見表4。結果表明紅芪精準煮散飲片煎出效果優于傳統飲片；采用SPSS 25.0分析，紅芪精準煮散飲片各成分與傳統飲片各對應成分有顯著性差異，紅芪精準煮散飲片1.00 g約相當于傳統飲片1.37 g。

表3 獨立性權重法計算結果

Table 3 Calculation results of independence weight method

成分R1/R權重/% 芒柄花苷0.9981.00232.65 毛蕊異黃酮0.9391.06534.71 芒柄花素0.9981.00232.64

表4 紅芪精準煮散飲片與紅芪飲片綜合得分比較

Table 4 Comparison of comprehensive scores between H. polybotrys precision boiled powder decoction pieces and H. polybotrys decoction pieces

樣品芒柄花苷毛蕊異黃酮芒柄花素綜合得分 紅芪精準煮散飲片85.1825.02290.57131.34 紅芪飲片60.9417.50213.5995.69

3 討論

歷代典籍對煮散和散劑的粒度描述有“粗末”“末”“細末”“如麻豆大”“粗散”等，煮散粉碎粒度對中藥有效成分的煎出影響較大，而確定傳統方劑中粒度描述與現代粒徑計量標準的一一對應關系則是煮散和散劑“遵古”開發的關鍵步驟[18]。本課題組制備紅芪精準煮散飲片的關鍵是確定其最佳粒度。經過反復試驗，比較不同粒度煮散飲片的煎煮效果及成分溶出度，確定了最佳粒度為0.200～0.400 cm。為了從實際可行性角度評估“遵古考證粒度”結果的可行性，對紅芪精準煮散飲片進行指紋圖譜研究及指標性成分含量測定，可為確定其與傳統飲片臨床用藥量的換算關系提供實驗證據。

本實驗分別考察了不同提取溶劑（水、50%～90%甲醇、50%～90%乙醇）、提取方法（超聲提取、回流提?。?、提取時間（20、30、40、50 min）對紅芪指紋圖譜的影響，結果顯示，70%甲醇提取時所得樣品的指紋圖譜出峰多，雜峰干擾較少，分離度好，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。不同提取方法、提取時間實驗結果表明，采用超聲提取與回流提取沒有顯著性差別，因回流提取操作較為復雜且轉移樣品易損失，故采用超聲提取；超聲40 min后色譜峰面積變化不大，說明提取完全，確定提取時間為40 min。

色譜條件優化根據已有關于紅芪藥材指紋圖譜及指標成分含量測定的文獻報道，采用乙腈-磷酸水系統作為流動相，254 nm為檢測波長?？疾炝?.1%甲酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸對指紋圖譜出峰情況及分離度的影響，結果顯示，用乙腈-0.2%磷酸緩沖液進行梯度洗脫，色譜峰型較為理想。

本實驗運用HPLC建立了紅芪精準煮散飲片指紋圖譜，對比紅芪精準煮散飲片和紅芪飲片3種指標成分的含量差異，并以芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄化素含量為評價指標，進行加權評分，得到紅芪精準煮散飲片約相當于1.37 g傳統飲片量的換算關系。本研究建立的指紋圖譜及含量測定方法可為紅芪精準煮散飲片的質量控制與評價提供依據。

煮散既保留了湯方特色，而較之湯劑，在提高藥物指標成分的煎出率、節省藥材、降低成本等方面具有極大的優越性，開發精準煮散飲片具有批量規模穩定化、批內質量均一化，可實現準確、高效自動化分裝、調劑、煎煮流程，且用藥量少、便于攜帶及服用等諸多優點，在臨床上具有廣闊應用前景。但煮散在煎煮過程中易出現糊鍋現象，含揮發性成分的煮散藥材在貯存過程中也存在成分易損失等問題。因此，對煮散的制備及其開發利用還需要進一步深入研究，如開展不同藥用部位及含有特殊成分中藥的煮散研究，進行針對煮散粗碎及貯存的專業儀器開發，以及煮散規范化制備及其質量控制標準研究等，為煮散的產業開發及臨床應用提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of HPLC fingerprint ofprecision boiled powder decoction pieces and determination of three indicative components

LI Shuo1, 2, 3, JU Rong1, YANG Xiu-Juan1, ZHAO Lin-hua4, TONG Xiao-lin4

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province, Lanzhou 730000, China 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality and Standard, Lanzhou 730000, China 4. Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100053, China

To establish the HPLC fingerprint and the content determination method of the three indicative components of Hongqi () precision boiled powder decoction pieces.HPLC was used to determine the contents of ononin, calycosin and formononetin intraditional decoction pieces andprecision boiled powder decoction pieces. The chromatographic column was Robusta C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm), the mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution, and the gradient elution was used. The detection wavelength was 254 nm; The flow rate is 1.0 mL/min; 20 μL of sample injection; Column temperature is 30 ℃.The characteristic fingerprint ofprecision boiled powder decoction pieces was established, and three main peaks of 20 common peaks, namely ononin (peak 11), calycosin (peak 13) and formononetin (peak 16), were identified. The linear relationship between the three components was good within their respective ranges (≥ 0.9995), with the average recovery rate of 98.08%—99.33% and RSD of 1.46%—2.37%. Through the weighted score, comparing these three components in theprecision boiled powder decoction pieces with the traditional decoction pieces, it is found that 1 g ofprecision boiled powder decoction pieces is about 1.37 g of the traditional decoction pieces.The established fingerprint and content determination method can provide the basis for the quality control and evaluation ofprecision boiled powder decoction pieces.

; precision boiled powder decoction pieces; HPLC; fingerprint; ononin; calycosin; formononetin; quality evaluation

R263.02

A

0253 - 2670(2022)16 - 5020 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.011

2022-02-16

國家自然科學基金資助項目（81960713）；國家自然科學基金資助項目（82160755）；甘肅省高等學校創新基金項目（2021A-079）；甘肅省自然科學基金項目（18JR3RA201）；甘肅省青年科技基金項目（20JR10RA331）；甘肅省中醫藥科研課題項目（GZKZ-2021-7）；甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室項目（zzy-2018-06）；敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室2020 年度開放課題（DHYX20-10）

李 碩（1981—），女，副教授，碩士生導師，主要從事中藥品質評價及產品開發研究。Tel: 13919824303 E-mail: 290608323@qq.com

仝小林（1956—），男，主任醫師，博士生導師，中國科學院院士。Tel: 13910662116 E-mail: tongxiaolin@vip.163.com

[責任編輯 鄭禮勝]