巴豆生物堿對Lewis小鼠肺腺癌細胞生長和凋亡的影響及機制研究*

武曉，谷勤勤，于淼淼，劉鳳娟，孫榮麗

（青島大學附屬青島市中心醫院1.呼吸與危重癥醫學科，2.病理科，3.放射科，山東青島 266042）

肺癌已經成為威脅人類健康的重大疾病之一，主要采取多學科綜合治療模式，而中西醫結合治療肺癌是我國的特色[1]。中藥抗肺癌的研究越來越多[2]，其中巴豆就是一種用于抗癌的中草藥[3-4]，查閱國內外文獻，巴豆生物堿（CA）是巴豆提取物的一種，CA 對于胃癌、卵巢癌、腸癌等癌癥均有抗癌作用[5-6]，但有關CA 抗肺癌作用的報道較少，前期的初步研究發現CA 具有較好的體內暴露量，能夠抑制肺癌的生長，但具體的作用機制尚不明確，目前國內外尚無關于CA 體內對肺癌細胞的作用機制及對腫瘤相關凋亡蛋白表達的影響的相關研究報道。那么CA 作用于體內是否可抗肺癌？是否通過誘導腫瘤細胞凋亡抗癌？具體機制是什么？為此本研究在前期體外試驗研究的基礎上行體內實驗（Lewis 肺腺癌小鼠），進一步探討CA 對肺腺癌生長和凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lewis 小鼠肺腺癌細胞（Lewis mouse-derived lung adenocarcinoma cells, LLC）由上海中國科學院提供；SPF 級C57BL/6 小鼠，4～6 周齡，雄性，體重25～30 g，共50 只，由重慶恩斯維爾生物科技有限公司提供[實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004]；DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）、水合氯醛、無水乙醇等購自北京中杉金橋生物技術有限公司；凋亡試劑盒及各引物購自上海生工生物工程股份有限公司；CA 購自山東中醫藥大學；順鉑購自德州德藥制藥有限公司；PrimeScript RT試劑盒購自日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設備

離心機購自上海安亭科學儀器廠；二氧化碳培養箱購自日本三洋公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 有限公司；電子分析天平購自瑞士Precisa 公司；生物組織自動包埋機、生物組織烤片機、DM500 光學顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制及分組將20 mg 順鉑溶于5 mL生理鹽水，即4 mg/mL，按照75 mg/m2給藥。CA 原液濃度為200 μg/ml，分別按照低劑量0.6 mg/kg、中劑量1.2 mg/kg 和高劑量2.4 mg/kg 對小鼠注射。將小鼠隨機分為對照組、低劑量CA 組、中劑量CA組、高劑量CA 組及順鉑組。對照組不注射任何藥物；低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組分別按0.6 mg/kg、1.2 mg/kg 和2.4 mg/kg 的劑量注射CA 注射液；順鉑組按75 mg/m2的劑量經腹腔注射順鉑溶液。

1.3.2 小鼠成瘤及瘤體測量①小鼠皮下接種。取對數生長期細胞，制成濃度為5×107個/mL 的細胞懸液，按照分組進行接種，每只小鼠于右腋皮下緩慢接種200 μL 細胞懸液，拔針后迅速用針頭將細胞聚集，以防止細胞液外漏。②成瘤觀察與測量。皮下接種成功后，每天觀察小鼠的精神狀況，形成腫瘤后，每2 天測量1 次腫瘤的長徑和短徑，并計算腫瘤的體積（腫瘤體積=0.52×短徑×長徑2）。③生存狀態的觀察。每天下午3 點記錄小鼠的進食量（先設定每組固定進食量為50 g），期間再觀察小鼠的精神、活動狀態，以及小鼠的毛色和光澤度等一般狀況。④差異化處理。接種細胞1 周后即第8 天開始按照之前的分組腹腔注射給藥，⑤腫瘤抑瘤率測定：剝取腫瘤后稱重，計算抑瘤率（抑瘤率=1-藥物組平均瘤重/對照組平均瘤重×100%）。

1.3.3 腫瘤病理切片的制備及蘇木精-伊紅染色先用二甲苯溶解烘烤完畢組織切片上殘留的石蠟，然后按以下順序進行梯度水化：無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，稀氨水返藍，伊紅染色，自來水洗去浮色后，可于光學顯微鏡下觀察染色情況。之后，按照80%、90%、95%乙醇，無水乙醇2 次，二甲苯2 次的順序進行脫水，最后用中性樹膠進行封片。

1.3.4 qRT-PCR 法檢測Survivin、Caspase-3、Bax、YAP mRNA 相對表達量提取細胞總RNA：細胞孔板中加300 μL Trizol，轉入EP 管中，加入氯仿（0.2 mL），待轉為粉色時，靜置5 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新EP 管，加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，離心棄上清液，加入75%乙醇1 mL，離心干燥EP 管中沉淀，溶解沉淀，溶解總RNA（55～60℃水浴5 min），檢測RNA 濃度和純度。RNA 質量測定：用DEPC 空白調零，吸取2 μL溶解后的總RNA 加入上樣孔，檢測光密度（OD）值，當OD 值介于1.8～2.0 之間（260/280），RNA純度好。使用PrimeScript RT 試劑盒（TaKaRa，Shiga，日本）將每個樣品的1 mg 總RNA 逆轉錄為cDNA，根據上海生工基因庫設計引物和探針。qRT-PCR 反應條件：50℃預變性2 min，95℃變性4 min，54℃再變性15 s，72℃退火5 s，83℃延伸15 s，最后，在72～95℃（0.5℃增量）下熔解，每個步驟熔解5 s。每個樣本以GAPDH為內參基因，將每個樣本的閾值周期（Ct）歸一化，每個樣本都是重復檢測的。按照2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量，通過每組3 個樣本的幾何平均值得到各基因的最終相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blotting檢測Survivin、Caspase-3、Bax、YAP 蛋白相對表達量Loading buffer 提取蛋白，RIPA 裂解液裂解30 min，將裂解液轉入EP 管中離心，置入-80℃冰箱冷凍保存。蛋白濃度測定及預變性：將蛋白標準品加入標準品稀釋液，加BCA 工作液，混勻，37℃孵育30 min；測定562 nm的OD 值，計算樣品蛋白濃度。根據分子量大小選擇濃度，配制分離膠混勻后灌膠，異丙醇液封壓膠，靜置30 min，棄掉異丙醇，濾紙吸干，加濃縮膠，插入梳子，靜置1 h。每組樣本各取10 μg 總蛋白與15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后應用80 V 恒壓轉膜120 min，封閉1 h，TBST 洗滌3 次；將PVDF 膜剪成條帶放入孵育皿中（按目的蛋白和Marker 分子量大小），上述4 種抗體及內參GAPDH以1∶1 000 4℃搖床上孵育，次日TBST 洗滌3 次，加入羊抗兔二抗孵育1 h，棄二抗，TBST 洗滌3 次。壓片，調整曝光時間，將X 射線片放入顯影液中，出現條帶后放入定影液中，取出X 射線片，風干，掃描圖片保存，采用Image J 軟件分析灰度值。以目的蛋白條帶與GAPDH 條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺癌LLC細胞生長狀態

光學顯微鏡低倍鏡下觀察細胞形態，小鼠LLC細胞呈上皮樣貼壁生長，有些細胞呈圓形、梭形，生長狀態良好。見圖1。

圖1 LLC細胞生長狀態 （光學顯微鏡×100）

2.2 CA 對LLC 細胞誘導的小鼠成瘤及一般狀況的影響

至取材之日，低劑量CA 組、高劑量CA 組及對照組各有1 只小鼠死亡；中劑量CA 組死亡2 只，順鉑組死亡3 只。模型復制1 周后，各組小鼠長出肉眼可見的腫瘤組織，各組小鼠在模型復制2 周左右開始出現不同程度的脫毛，食欲不振，毛發干枯，不喜動，有的小鼠出現明顯消瘦等情況，尤以順鉑組小鼠最為明顯。而高劑量CA 組和低劑量CA 組小鼠脫毛、食欲不振及活動敏感度下降等情況比順鉑組好，毛色比順鉑組組有光澤。

2.3 CA對LLC細胞誘導的小鼠成瘤體積的影響

對照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組的腫瘤體積分別為（4.09±0.24）cm3、（3.09±0.58）cm3、（2.91±0.64）cm3、（2.59±0.89）cm3和（1.98±1.04）cm3，經方差分析，差異有統計學意義（F=26.652，P=0.010）。進一步兩兩比較，對照組腫瘤體積大于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05）；順鉑組腫瘤體積小于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05）；高劑量CA 組腫瘤體積小于低劑量CA 組和中劑量CA 組（P<0.05）。各組腫瘤體積隨劑量增加體積逐漸縮小，對照組腫瘤生長最快，順鉑組腫瘤生長最慢。

2.4 CA對瘤重及抑瘤率的影響

對照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組瘤重比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組腫瘤重量逐漸減少，對照組瘤重最大，順鉑組瘤重最小。低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組的抑瘤率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），各組抑瘤率依次升高，順鉑組腫瘤生長最慢（P<0.05）。見表2。

表2 各組瘤重、抑瘤率的比較

2.5 各組小鼠LLC細胞病理形態學變化

對照組：細胞生長活躍，發現大量腫瘤細胞，核質粗、深染，核仁明顯，核分裂象多見，可見大量細胞壞死，但細胞凋亡不明顯（見圖2）。低劑量組：細胞凋亡比例較低，但有凋亡現象，大部分細胞為壞死細胞（見圖3）。中劑量組：細胞壞死和細胞凋亡現象均可見（見圖4）。高劑量組：可見細胞壞死，凋亡現象多，間質可見紅細胞滲出，細胞分裂象減少，可見散在許多凋亡小體（見圖5）。順鉑組：可見腫瘤細胞出現明顯的凋亡現象，可見形成的凋亡小體，細胞質深嗜伊紅，細胞核濃染（見圖6）。

圖2 對照組LLC細胞病理學形態

圖3 低劑量組LLC細胞病理學形態

圖4 中劑量組LLC細胞病理學形態

圖5 高劑量組LLC細胞病理學

圖6 順鉑組LLC細胞病理學形態

2.6 各組LLC 細胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA 相對表達量的比較

對照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組LLC 細胞Survivin、Caspase-3、Bax mRNA相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，對照組Survivin mRNA 相對表達量高于不同劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Survivin mRNA 相對表達量高于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。對照組Caspase-3、Bax mRNA 相對表達量低于不同劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Caspase-3 、Bax mRNA 相對表達量低于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。各組YAP mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組LLC細胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相對表達量的比較 （±s）

表3 各組LLC細胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與低劑量CA組比較，P<0.05。

組別對照組低劑量CA組中劑量CA組高劑量CA組F 值P 值YAP mRNA 1.613±0.247 1.229±0.037 1.381±0.207 1.484±0.195 3.019 0.128 Survivin mRNA 3.148±0.211 2.618±0.065①1.590±0.025①②1.304±0.098①②28.532 0.009 Caspase-3 mRNA 1.754±0.102 2.601±0.278①3.629±0.086①②3.861±0.088①②16.413 0.018 Bax mRNA 2.241±0.101 3.451±0.191①5.309±0.156①②6.182±0.050①②6.409 0.014

2.7 各組LLC 細胞Survivin、Caspase-3、Bax 及YAP蛋白相對表達量的比較

對照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組Survivin、Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，對照組Survivin 蛋白相對表達量高于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Survivin 蛋白相對表達量高于中劑量CA組和高劑量CA 組（P<0.05）。對照組Caspase-3、Bax 相對表達量低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Caspase-3、Bax蛋白相對表達量低于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。各組YAP 蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 各組LLC細胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相對表達量的比較 （±s）

表4 各組LLC細胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與低劑量CA組比較，P<0.05。

組別對照組低劑量CA組中劑量CA組高劑量CA組F 值P 值YAP蛋白1.113±0.047 1.166±0.068 1.043±0.032 1.101±0.079 3.391 0.110 Survivin蛋白0.892±0.0349 0.706±0.087①0.451±0.032①②0.319±0.025①②18.532 0.016 Caspase-3蛋白0.251±0.055 0.480±0.047①1.005±0.034①②1.298±0.094①②22.413 0.009 Bax蛋白0.243±0.045 0.295±0.089①0.631±0.056①②0.882±0.096①②16.409 0.018

3 討論

肺癌目前仍是最常見的腫瘤之一[7]，其發病率和病死率均占腫瘤死亡患者的前位，2019年國家癌癥中心關于惡性腫瘤流行情況分析報告指出肺癌的發病率和病死率仍居榜首，中國每年約有6 萬患者因肺癌死亡[8]。最近研究表明，中藥能在腫瘤的整個過程中發揮重要的預防和治療作用。中藥在預防和治療肺癌中有自己的優勢[9-10]。巴豆是一種流傳于民間，用于抗癌的中草藥，民間早已應用巴豆的提取物治療惡性腫瘤，但關于巴豆提取物的具體抗癌機制研究較少。近年來，對巴豆及其提取物抗腫瘤作用機制的最新研究進展主要集中在以下幾個方面：①影響膜系統分子動力學[11]；②誘導腫瘤細胞的凋亡：如CA 會抑制人卵巢癌細胞（HO-8910）的增殖，使其發生細胞凋亡[12]；③可誘導腫瘤分化和抗氧化、抑制腫瘤轉移[13]；④可改變癌細胞的胞漿結構和破壞癌細胞的微管等[14]。以上機制相互影響相互作用，起到抗腫瘤作用。

目前肺腺癌發病率最高[15]，筆者前期已經進行了CA 對肺腺癌A549 細胞凋亡機制的體外實驗研究，本研究通過體內實驗進一步探討CA 對肺腺癌生長的作用及具體的凋亡機制。本研究首先從復制動物模型開始，因小鼠的肺臟在分子特點、組織形態等方面與人類相似，而且兩者的基因有90%以上同源性，所以復制小鼠肺腺癌模型更具有意義。本實驗選用LLC 細胞，主要是由于LLC 腫瘤細胞來源于C57BL/6 小鼠的自發性肺腫瘤。將其接種于C57B/6 小鼠皮下，具有同種移植、成瘤率高、且生長較快等優點。本研究分兩部分進行。第一部分為CA 對Lewis 小鼠肺腺癌細胞生長的研究：實驗結果順鉑組小鼠死亡數目最多，可能是因為化療藥物副作用太大，不能耐受所致。順鉑組小鼠腫瘤生長雖然比對照組、低劑量CA 組、中劑量CA組、高劑量CA 組速度明顯減慢，但出現體重下降，食欲差的現象，與臨床上順鉑化療后出現消化道副作用相符，可見順鉑對患者身體素質要求高，使用較局限。不同CA 組可抑制腫瘤生長速度，雖不如順鉑組明顯，但小鼠生活狀態良好。說明CA 更能提高生活總體質量。通過瘤重、瘤體體積及抑瘤率，發現CA 對Lewis 小鼠肺腺癌細胞的生長具有抑制作用，且隨著CA 濃度的增加，抑制作用增強，說明CA 可以抑制腫瘤細胞生長，并與CA 濃度相關。繼續增加CA 劑量后是否抑瘤效果更好？副作用更大？這一點可以通過后續的實驗進一步證實。形態學觀察發現，隨CA 濃度的升高，腫瘤細胞凋亡率不斷增加，但均沒有順鉑組凋亡率高，說明CA 對肺腺癌細胞生長抑制作用不如順鉑組，但副作用較小。結果提示，在不能完全耐受順鉑治療的患者中，可以嘗試應用CA 進行聯合治療，減少順鉑用量，以減輕副作用。為進一步明確CA 通過何種途徑促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長，本研究通過檢測凋亡相關蛋白的表達，探討其具體凋亡機制。

凋亡有內源性和外源性凋亡途徑[16]，內源性途徑在細胞凋亡中起到決定性作用[17]。Bax 屬于Bax亞家族之一，具有促凋亡作用，在凋亡過程中扮演重要角色[18]；Survivin 是迄今發現最強的凋亡抑制因子[19]；Caspase-3 是一種終末剪切酶，在細胞凋亡過程中發揮重要作用[20]， 且Survivin 是Caspase-3 的直接抑制劑[21]；Hippo-YAP 信號轉導通路在細胞中調節各類轉錄因子，調控細胞的增殖和凋亡[22-23]。本研究Survivin mRNA 在不同劑量CA組中的相對表達量低于對照組，CA 劑量越高，Survivin mRNA 的相對表達量越低；而Bax mRNA 和Caspase-3 mRNA 在不同劑量CA 組中的相對表達量高于對照組，CA 劑量越高，Bax mRNA 和Caspase-3 mRNA 的相對表達量越高；筆者猜測CA 對Lewis 小鼠肺腺癌細胞生長的機制與Bax 和Caspase-3 表達上調及Survivin 表達下調從而抑制細胞的增殖和凋亡有關；YAP 在各組中變化不明顯，Hippo-YAP 信號轉導通路不是CA 引起Lewis 小鼠細胞凋亡的主要通路，有可能是本研究的樣本量太少，有待于進一步加大樣本量進行研究。

綜上，CA 可誘導Lewis 小鼠肺癌細胞凋亡，其可能的機制可能是因為Survivin 是Caspase-3 的直接抑制劑，Survivin 和Bcl-2 可能具有調節細胞凋亡的共同途徑，CA 抑制了Survivin 的表達，從而使得Survivin 對Caspase-3 蛋白的抑制作用減弱，使得Caspase-3 的剪切增強，由于CA 可使Bax 表達增強，其與線粒體體外膜結合，將Cyt-c 釋放到細胞質中，與其他細胞因子結合形成凋亡小體并募集和激活Caspase-3 蛋白，從而誘導Caspase 級聯效應并因此促進細胞凋亡，起到抗腫瘤生長的作用。參與肺腺癌的凋亡相關因子眾多[24-25]，如β-抑制蛋白2 基因，鈣結合蛋白家族成員S100A6基因等，本研究僅從體內實驗初步探討CA 引起肺腺癌細胞凋亡的作用機制，以及阻止腫瘤復發和轉移的機制，同時涉及多個分子和信號通路。僅用一個方面說明或評估肺腺癌細胞凋亡的發生機制無說服性，需要更深一步探討，筆者認為可在此基礎上運用高通量測序等高水平檢測方法，進一步研究參與凋亡的其他凋亡蛋白和信號通路，以明確起最主要作用的凋亡蛋白和信號通路，為肺腺癌治療提供新的思路。