熱處理及抗氧化劑叔丁基對苯二酚預處理對南極磷蝦肉油脂消化特性的影響

豈玉麗，高翠竹，王際輝,2，劉玉佳,

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116034；2.東莞理工學院化能學院科技創新研究院，廣東東莞 523808）

南極磷蝦（Euphausia superba），又名大磷蝦或南極大磷蝦，是地球上數量最大的單種生物資源之一[1]。南極磷蝦資源豐富[2]，生物量巨大[3]，生物學年可捕量達1 億噸[4]。南極磷蝦脂肪含量豐富，據統計，在不同海域、不同季節捕撈的南極磷蝦，其脂肪含量為12%～50%，且南極磷蝦多不飽和脂肪酸（PUFA）和磷脂（PL）含量極為豐富[5]。此外，南極磷蝦富含蛋白質和氨基酸，同時含有蝦青素、甲殼素等海洋活性成分[6-8]。

熱處理是南極磷蝦產品深加工的必要工序，周大勇[9]發明的一種低氟南極磷蝦去殼蝦粉的制備方法中，南極磷蝦肉需經過60～90 ℃熱處理。但熱處理也影響蝦類產品的品質，高翠竹等[10]發現經由85 ℃溫度下熱風處理南極磷蝦肉2 h，此條件下與未經加熱組相比油脂過氧化值、TBA 值、酸值均顯著性增加，表明熱處理方式降低南極磷蝦肉油脂品質。同時，也有其他學者報道，不同的熱處理方法會加速消化過程中油脂的氧化，Sun 等[11]研究了不同處理方法對豬肉在人體體外消化過程中脂質消化率和膽固醇氧化產物（COPs）形成的影響。分別用烤箱、煎鍋、煮沸和微波方式將豬肉餡餅加熱至內部溫度約85 ℃，然后用體外消化模型對豬肉肉餅的消化率進行評估，發現與其他蒸煮方法相比，微波加熱消化后導致油脂的游離脂肪酸和硫代巴比妥酸反應性物質含量增多。而由熱處理所導致南極磷油脂氧化的問題，會不會在消化過程中加劇，如何削弱這種氧化反應的產物影響目前尚未可知。

添加抗氧化劑是常用的食品生產加工過程中用來延緩氧化、延長食品保質期的有效手段。食用油脂中允許使用的合成抗氧化劑有叔丁基對苯二酚（TBHQ）、丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）和沒食子酸丙酯（PG）等，其中TBHQ、BHA和BHT 被允許添加在堅果與籽類罐頭、膨化食品、油炸面制品、方便米面食品及風干、烘干、壓干水產品中[12]。TBHQ 是《GB 2760-2014 食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定，允許使用的添加劑，最大使用劑量為0.2 g/kg[13]。研究表明，TBHQ 的抗氧化能力是BHA 和BHT 的2～5 倍，且在高溫下較穩定[14]。吳丹蕾等[15]發現分別在140、160 和180 ℃下對菜籽油加熱30 min，添加TBHQ 會顯著降低油脂的過氧化值，對酸值和菜籽油感官品質無明顯影響。

本實驗構建體外模擬胃腸道消化模型，以油脂的過氧化值、丙二醛含量、酸值、蝦青素含量和脂肪酸組成為評價指標，研究三種不同處理方法的南極磷蝦肉油脂（未經任何處理的空白組蝦肉油脂、熱處理（85 ℃）后的磷蝦肉油脂和添加抗氧化劑熱處理后的磷蝦肉油脂）經胃道和胃腸道消化后氧化穩定性和營養成分的變化情況，反映熱處理對南極磷蝦肉油脂消化特性的影響情況以及添加抗氧化劑是否是削弱油脂消化品質影響的防控辦法，以期為南極磷蝦的加工利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦肉 遼寧省大連海洋漁業集團公司提供，置于-20 ℃儲存備用；正己烷、氯仿、甲醇、氯化亞鐵、硫氰酸鉀、氫氧化鈉、堿藍6B、硫代巴比妥酸、正丁醇、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、三氟化硼甲醇溶液 大連博諾生物化學試劑廠；TBHQ 浙江一諾生物科技有限公司；磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；脂肪酶（20000 U/g）、膽酸鈉美侖生物有限公司；胃蛋白酶（400 U/mg protein）、蝦青素標準品 Sigma 公司；無水乙醇 遼寧泉瑞試劑有限公司；以上試劑 均為分析純；胰酶（USP級）、三氯乙酸（分析純）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷（分析純）、正庚烷（色譜純）阿拉丁。

FD-1C-50 真空冷凍干燥機 北京博醫康試驗儀器；GFL-230 鼓風干燥箱 天津市萊玻特瑞儀器公司；V-1000 可見分光光度計 翱藝儀器（上海）公司；6890N GC-5973 MSD 氣質聯用儀 安捷倫公司；高效液相色譜儀E2695 Waters 公司；BJ-800A粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦肉的處理及蝦油提取 將冷凍南極磷蝦肉于4 ℃解凍，瀝水后進行三種不同的前處理：

空白組：蝦肉搗碎平鋪放至-80 ℃冰箱中預凍，冷凍干燥。

熱處理組：蝦肉搗碎后平鋪于不銹鋼盤中，放至85 ℃烘箱中加熱2 h，冷凍干燥。

熱處理及抗氧化劑TBHQ 預處理組：蝦肉搗碎平鋪稱重記錄，抗氧化劑添加方法如下[16]：稱取占蝦肉質量5%的無水乙醇，按照國家食品添加劑使用標準中TBHQ 的最大使用劑量（0.2 g/kg）將TBHQ 溶于乙醇，均勻噴灑于蝦肉表面；放至85 ℃烘箱中熱處理2 h，冷凍干燥。

取不同處理組的蝦粉經由粉碎機粉碎得到均一細膩的南極磷蝦粉，每次取100 g 備用提油。參考田創[17]的方法，按料液比1:15（w/v）用正己烷和無水乙醇以2:1 配比提取南極磷蝦肉脂質，將混合液置于40 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌浸提90 min，浸提完成后靜置過夜[17]。取上清液進行抽濾，在40 ℃下真空旋轉蒸發除去正己烷和乙醇溶液，用氮氣吹干后得到南極磷蝦肉油脂。

1.2.2 體外消化模型的建立

1.2.2.1 試劑配制 胃液：NaCl 3 g，KCl 1.06 g，CaCl2·2H2O 1.47 g，KH2PO40.47 g，MgCl2·6H2O 0.74 g，脂肪酶5.6304 g，胃蛋白酶23.4612 g，水1 L。

腸液：胰酶8 g，膽酸鈉25 g，水1 L。

1.2.2.2 體外模擬消化實驗 胃消化階段：稱取0.1～0.2 g 油脂于50 mL 離心管中，準確加入3 mL 胃液，用1 mol/L NaHCO3調pH 至4.0 左右，放至37 ℃、350 r/min 搖床中振蕩反應30 min。再用1 mol/L 鹽酸溶液調pH 至2.0 左右，放于37 ℃、350 r/min 搖床中振蕩反應30 min[18]。

胃腸消化階段：胃消化完成后，用1 mol/L NaHCO3溶液將pH 調至6.9，加入0.6 mL 腸液，用氮氣沖洗15 s，渦旋15 s，再用氮氣沖洗15 s 后密封，在37 ℃、350 r/min 搖床中振蕩反應120 min。

1.2.3 過氧化值的測定 參照《GB/T 5009.37-2003食用植物油衛生標準的分析方法》中第二法—比色法測定試樣中的過氧化物，在500 nm 下測定橙紅色硫氰酸鐵配合物的吸光度，對照標準曲線計算樣品的過氧化值[19]，實驗所需標準曲線的回歸方程為y=0.0493x-0.0138，R2=0.997。

1.2.4 丙二醛含量的測定 參照《GB 5009.181-2016食品中丙二醛的測定》中分光光度法測定[20]，通過在532 nm 測樣品的吸光度，帶入標準曲線中計算丙二醛含量，實驗所需標準曲線的回歸方程為y=0.1279x-0.0003，R2=0.990。

1.2.5 酸值的測定 參照《GB 5009.229-2016 食品安全國家標準食品中酸價的測定》中第三法，用熱乙醇指示劑滴定法測定南極磷蝦肉油脂的酸值[21]。

1.2.6 蝦青素含量的測定 蝦青素標準曲線制備參照宋玉昆[22]的方法：準確稱取2.5 mg 蝦青素標準品，加入10 mL 色譜級丙酮充分溶解，移至25 mL 棕色容量瓶中并用丙酮定容至刻度，此時蝦青素溶液濃度為100 μg/mL 為蝦青素標準儲備液。將蝦青素標準儲備液用色譜級丙酮稀釋成濃度分別為1、2、3、4 和5 μg/mL 的標準工作液，現配現用。使用高效液相色譜儀進行檢測，以蝦青素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線為y=99624x-37228，R2=0.983。

樣品處理：向體外消化后的樣品中加入5 mL 氯仿溶液，渦旋60 s 充分混勻，在4 ℃、2000×g 的條件下離心6 min，將氯仿相移至15 mL 離心管中，用氮氣吹干得到消化后的油脂。蝦青素的皂化參照宋玉昆[22]的方法，向離心管中加入5 mL 無水乙醇，再加入2 mL 氫氧化鈉-乙醇溶液（0.105 mol/L），用乙醇定容至10 mL，混合均勻。充氮密封。將離心管用錫紙避光，放至5 ℃冰箱中反應3.5 h。再加入2 mL磷酸-乙醇溶液（0.105 mol/L），混合均勻，5000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜后進行液相分析。蝦青素含量計算公式如下：

式中：X 表示試樣蝦青素含量，μg/g；A 表示試樣的峰面積，mAU×min；12 表示蝦青素測定體系總體積，mL；m 表示油脂質量，g。

1.2.7 脂肪酸組成分析 脂肪酸的甲酯化參照陰法文[24]的方法并略作修改：向體外消化后的樣品中加入5 mL 氯仿溶液，渦旋60 s 充分混勻，在4 ℃、2000×g的條件下離心6 min，將氯仿相移至厭氧管中，用氮氣吹干。取吹干油脂于厭氧管中，加入1 mL KOHCH3OH 溶液（2 mol/L），密封后于85 ℃加熱2 h 進行皂化，皂化結束后趁熱加入1.5 mL BF3-CH3OH溶液，在85 ℃水浴30 min；冷卻后加入1 mL 色譜級正庚烷，超聲振蕩5 min，再加入1 mL 飽和NaCl溶液洗滌，振蕩30 s，置于4 ℃冰箱靜置分層后取上層液體進行氣相色譜-質譜（GC-MS）分析。

GC-MS 分析脂肪酸組成檢測：參考陰法文[24]的方法并略作修改。使用氣質聯用儀對樣品進行分析，選用HP-5-MS 毛細管柱（30 m×0.25 m×0.25 μm）作為色譜柱。初始溫度50 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升高至170 ℃，以4 ℃/min 升高至290 ℃，保持10 min。進樣體積為5 μL，分流比50:1，使用氦氣為載氣。質譜分析采用EI 源（70 eV），選取Scan 模式，掃描范圍50～550 m/z，溶劑延遲4 min。根據GC-MS 中各組分保留時間及質譜圖，在NIST08 庫檢索鑒定，通過歸一法計算各脂肪酸的百分比。

1.3 數據處理

實驗數據均以平均值±標準偏差表示，并采用SPSS 22.0 統計學軟件對實驗所得各組數據進行單因素方差分析（ANOVA 中的Tukey），在P＜0.05 時認為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 熱處理及TBHQ 對南極磷蝦肉油脂消化過程中過氧化值的影響

將三種不同處理組的油脂在體外消化模型中經由胃消化和胃腸消化，用比色法測定消化前后油脂的過氧化值，結果如圖1 所示。

圖1 體外消化前后油脂過氧化值的變化Fig.1 Changes in lipid peroxidation value before and after in vitro digestion

過氧化值是衡量油脂氧化變質的重要指標之一，但過氧化物只是油脂氧化初期的產物，只能用來衡量油脂初期氧化酸敗的程度[25]。分析圖1 可知，經過胃消化和胃腸消化后的油脂，不同處理組過氧化值均有不同程度的上升。空白組油脂經胃消化后，過氧化值由0.884 meq/kg 顯著上升至2.005 meq/kg（P＜0.05），說明胃部的消化加速了油脂的初級氧化，這個結果可能是胃液中的各種無機鹽和胃蛋白酶中的金屬離子等導致的。胃腸消化后油脂過氧化值為1.528 meq/kg，較起始狀態過氧化值顯著升高（P＜0.05），較胃消化過氧化值略有降低，可能是脂肪酶和膽酸鹽加速了脂質的氧化進程，氫過氧化物生成的速度小于分解的速度，所以在胃腸消化過氧化值低于胃消化。85 ℃熱處理組油脂經胃消化過氧化值由1.219 meq/kg 顯著升高至1.799 meq/kg（P＜0.05），胃腸消化后略有降低至1.696 meq/kg，與空白組變化趨勢相似。添加TBHQ 組脂質起始、胃消化、胃腸消化的過氧化值均無顯著差異（P＞0.05）。與Larsson等[18]研究的魚肝油及魚肝油乳液體外消化過程中過氧化值變化趨勢一致，均隨體外消化過程的進行，油脂過氧化值水平升高，說明體外消化過程加速油脂的初級氧化。

采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析處理，計量資料以（均數±標準差）表示，采用t檢驗；計數資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

南極磷蝦肉油脂體外消化的油脂氧化程度指標結果表明，空白組和85 ℃熱處理組油脂在起始、胃消化和胃腸消化的過氧化值無顯著差異（P＞0.05），說明熱處理對油脂消化過程中氫過氧化物含量無影響。比較85 ℃熱處理組和添加TBHQ 熱處理組在起始、胃消化和胃腸消化的過氧化值，發現熱處理及TBHQ 預處理組脂質在胃消化、胃腸消化過氧化值較85 ℃處理組雖有略微下降，但二者相比無顯著差異（P＞0.05），但TBHQ 預處理組的起始、胃消化、胃腸消化的過氧化值均無顯著差異（P＞0.05），說明TBHQ 在胃消化、胃腸消化過程中具有一定的抗氧化作用，但在熱處理條件下抗氧化效果并不顯著，其抗氧化效果不足以抵消熱處理的促氧化效果。

2.2 熱處理及TBHQ 對南極磷蝦肉油脂消化過程中丙二醛的影響

將三種不同處理組的油脂在體外消化模型中經由胃消化和胃腸消化，用比色法測定消化前后油脂的丙二醛含量，體外消化前后蝦肉油脂丙二醛含量的變化如圖2 所示。

圖2 體外消化前后油脂丙二醛含量的變化Fig.2 Changes in lipid malondialdehyde content before and after in vitro digestion

丙二醛是油脂氧化變質生成的過氧化脂質，在熱、光、重金屬等過氧化物分解因子存在下，進一步分解產生的一種醛類物質[26]。其含量可以用來表征油脂次級氧化的程度。由圖2 可知，空白組、85 ℃熱處理組和添加TBHQ 熱處理組油脂經過胃消化、胃腸消化，丙二醛含量均呈上升趨勢。經由胃腸消化后的空白組、85 ℃熱處理組丙二醛含量顯著高于起始的丙二醛含量（P＜0.05）。空白組油脂經胃消化后丙二醛含量由11.97 mg/kg 上升至151.36 mg/kg，經胃腸消化后上升至185.29 mg/kg；85 ℃熱處理組油脂經胃腸消化后丙二醛含量由起始的13.67 mg/kg升高至362.44 mg/kg；添加TBHQ 熱處理組油脂經胃消化和胃腸消化后丙二醛含量由54.64 mg/kg分別上升至106.35、210.47 mg/kg。與Larsson 等[18]研究的魚肝油及魚肝油乳液體外消化過程中硫代巴比妥酸值變化趨勢一致，均隨體外消化過程的進行，油脂丙二醛含量升高，說明體外消化過程加速油脂的氧化。同時，在文獻[27-30]的研究中，均發現熱處理會加速不同肉品如火雞肉、豬肉、雞肉消化過程的丙二醛含量，與本文實驗結果相一致。

胃消化沒有使不同處理組丙二醛含量有顯著差異的原因可能是胃部消化系統脂肪酶含量低，不足以促使油脂次級氧化劇烈發生。經過胃腸消化反應后，丙二醛含量顯著上升（P＜0.05），可能是胰脂肪酶和膽酸鹽發揮了促氧化作用。比較分析胃腸消化后三種油脂的丙二醛含量變化，發現熱處理導致丙二醛含量明顯上升，促進油脂次級氧化程度加深，添加TBHQ 能夠有效抑制熱處理后蝦肉油脂的丙二醛生成，降低油脂丙二醛含量，使其與空白組相比無顯著差異（P＞0.05）。目前普遍認為TBHQ 的抗氧化機理與其它常用酚類抗氧化劑作用機理相同，主要表現為：TBHQ 作為自由基吸收劑提供氫質子與油脂自由基結合將其還原為甘三酯分子或與油脂過氧化自由基結合生成氫過氧化物以終止自由基連鎖反應的傳遞，而生成的酚類自由基活性很低，可形成穩定的共振體或參與鏈終止反應，從而中斷油脂的氧化[31]。

2.3 熱處理及TBHQ 對南極磷蝦肉油脂消化過程中酸值的影響

將三種不同處理組的油脂在體外消化模型中經由胃消化和胃腸消化，用熱乙醇滴定法測定消化前后油脂的酸值，體外消化前后南極磷蝦肉油脂酸值的變化如圖3 所示。

圖3 體外消化前后油脂酸值的變化Fig.3 Changes in lipid acid value before and after in vitro digestion

酸值表示的是中和1 g 脂肪中的游離脂肪酸所需要的氫氧化鈉的毫克數[32]。由圖3 可以看出，南極磷蝦油脂酸值隨著胃消化、胃腸消化作用，呈現先上升后下降的趨勢，三種不同處理組油脂胃消化后的酸值水平均高于胃腸消化后的酸值水平，胃消化、胃腸消化后酸值水平均高于起始狀態酸值。同時，三種不同處理組在同一消化環境下的酸值無組間差距，說明在體外消化過程中，熱處理和TBHQ 對油脂酸值無顯著影響（P＞0.05）。Ju 等[33]研究的大豆蛋白-花青素大豆油乳液體外消化過程后游離脂肪酸的含量隨體外消化過程進行而增加，說明體外消化過程加速油脂水解生成游離脂肪酸，同本文研究結果一致。

胃消化后酸值顯著上升（P＜0.05），表明游離脂肪酸增多，且胃消化后油脂酸值水平高于胃腸消化后油脂酸值水平，推測可能的原因有以下兩個；一是胃中的強酸環境對此過程有促進作用，導致游離脂肪酸增多，所以胃消化后的酸值上升程度非常明顯，二是可能胃脂肪酶對脂肪進行特異性消化作用導致，且胃中的鹽離子對此過程可能有協同作用。胃消化后的物質進入腸道，在胰脂肪酶和膽酸鹽的作用下繼續被消化。經過胃腸消化后油脂的酸值較起始狀態有顯著升高（P＜0.05），可能是腸道中的胰脂肪酶和膽酸鹽發揮了作用，促使油脂發生水解。胃腸消化后酸值較胃消化后酸值水平低，可能是由于腸道較胃道pH 變化使得中和1 g 化學物質所需的氫氧化鉀（KOH）的毫克數減少導致。

2.4 熱處理及TBHQ 對南極磷蝦肉油脂消化過程中蝦青素含量的影響

將三種不同處理組的油脂在體外消化模型中進行胃消化和胃腸消化，重提油脂，用高效液相色譜法測定蝦青素含量的變化，結果如圖4 所示。

圖4 體外消化前后蝦青素含量的變化Fig.4 Changes in astaxanthin content before and after in vitro digestion

蝦青素是一種萜烯類不飽和化合物，具有很長的共軛雙鍵，且含有不飽和酮基和羥基。蝦青素的抗氧化能力極強，且是一種的天然抗氧化劑，蝦青素穩定性不高，易氧化、易見光分解。在南極磷蝦中主要以蝦青素酯的形式存在，而酯化的蝦青素更加穩定。分析圖4 可知，起始階段三組不同處理組油脂的蝦青素含量并無顯著差異（P＞0.05），經過胃消化、胃腸消化后空白組和85 ℃處理組油脂蝦青素含量顯著降低（P＜0.05），TBHQ 預處理組油脂蝦青素也略有降低，這可能是蝦青素在胃消化、胃腸消化過程中能夠有效淬滅單線態氧、清除自由基、中止自由基鏈式反應、抑制油脂過氧化，導致自身消耗所致[34]。

Nuntarat 等[35]觀察到蝦青素保留率隨著儲存時間和溫度的增加而降低。與低溫（5、25 和37 ℃）相比，在高溫（55 和70 ℃）條件下的蝦青素保留率較低，且蝦青素降解速率隨貯藏溫度的升高而增大。

2.5 熱處理及TBHQ 對南極磷蝦肉油脂消化過程中脂肪酸組成的影響

三種不同處理組的油脂在體外消化模型中進行胃消化和胃腸消化，重提油脂，脂肪酸組成變化結果如表1 所示。

表1 體外消化前后脂肪酸組成的變化Table 1 Changes in fatty acid composition before and after in vitro digestion

分析表1 數據可知，三種不同處理組油脂起始階段和胃消化后飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸占比無顯著性差異（P＞0.05），胃消化和胃腸消化后飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸占比無顯著差異（P＞0.05）。三種不同處理組油脂的單不飽和脂肪酸在體外消化過程中無明顯變化（P＞0.05），熱處理或添加抗氧化劑對單不飽和脂肪酸占比無影響。說明熱處理和TBHQ 添加對南極磷蝦肉油脂的消化過程脂肪酸組成并無顯著作用。

3 結論

南極磷蝦肉油脂體外消化過程中油脂氧化程度指標和營養成分變化結果表明：空白組油脂的過氧化值、酸值、丙二醛含量經胃腸消化后顯著提高（P＜0.05），蝦青素含量顯著下降（P＜0.05），脂肪酸組成無顯著變化（P＞0.05），說明胃腸消化過程可以加速油脂初級氧化、次級氧化進程，并且伴隨著加速游離脂肪酸產生和蝦青素的抑制脂質過氧化，導致蝦青素含量的減少；85 ℃熱處理組油脂經胃腸消化后的過氧化值、丙二醛含量、酸值、蝦青素含量和脂肪酸組成變化趨勢與空白組基本保持一致。但與空白組相比，85 ℃熱處理組經胃腸消化后丙二醛含量顯著高于空白組（P＜0.05），說明85 ℃熱處理加速了油脂消化的次級氧化進程；添加抗氧化劑TBHQ 預處理組油脂過氧化值和丙二醛含量較起始無顯著變化，表明添加抗氧化劑TBHQ 可以有效延緩油脂在胃腸消化中的初級、次級氧化反應，但對游離脂肪酸產生和蝦青素含量下降無作用；熱處理和TBHQ 添加后模擬體外消化過程對南極磷蝦肉油脂飽和脂肪酸比和不飽和脂肪酸比例無顯著影響。本研究證明了消化過程對南極磷蝦肉油脂的氧化促進作用，同時探討了熱處理對南極磷蝦肉油脂在消化過程中的氧化加劇，以及TBHQ 在熱處理和消化過程的抗氧化作用，為熱處理南極磷蝦肉產品的消化特性解析及防控辦法提供理論依據。