保健食品中黃曲霉毒素檢測方法的研究

肖雪梅，曾冬燕，邱 妹，秦 菁，黃 玲

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

由于黃曲霉素是一種致癌物質，如果不小心誤食了黃曲霉素，積累過多會導致身體內的癌細胞病變，從而導致癌癥。一些食物含有黃曲霉素，消費者一定要先了解食物所含成分再吃。檢測黃曲霉毒素的方法有很多，如薄層分析法（TLC）、液相色譜法（HPLC）、酶聯免疫法（ELISA）[1-5]，現在主要研究酶聯免疫法（ELISA），因為該方法具有檢測速度快、靈敏性高、選擇性強等優點，但該方法會存在假陽性的現象，而且試劑盒需低溫保存、只能用1 次，不能循環使用[6-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標儀（Multiskan FC）；離心機，上海安亭科學儀器廠產品；洗板機（Thermo）。

黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，河北伊萊莎生物技術有限公司提供；氯化鈉、無水甲醇、三氯甲烷、無水硫酸鈉，廣州化學試劑廠提供；實驗室用水（純化水）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

70%甲醇/水溶液體積比70∶30。

1.2.2 樣品前處理

①稱取5 g 樣品于50 mL 離心管中，加0.5 g NaCl，再加入25 mL 甲醇/水溶液；②蓋好蓋子高速振蕩3 min（或搖床振蕩 10～15 min），靜置 5 min（或以轉速4 000 r/min 離心5 min） 后用定量濾紙過濾，收集濾液，此為樣品待檢液。注意：如果收集的濾液顏色比較深，則需要提油。提油的方法為吸取中層甲醇/水溶液4 mL 于分液漏斗中，加8 mL三氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，將下層三氯甲烷層盡量完全放入第2 只分液漏斗中，如出現乳化現象可滴加甲醇促使分成。采取相同的方法，在分液漏斗中再加5 mL 三氯甲烷，收集三氯甲烷層一并經盛有約10 g 預先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢性濾紙過濾于50 mL 圓底燒瓶中，最后用少量三氯甲烷清洗過濾裝置，洗滌于圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發儀在65 ℃條件下蒸干，加入70%甲醇/水溶液4 mL 后溶解，為待檢液。

1.2.3 免疫檢測程序

（1） 清洗液的準備。根據需要量將濃縮液稀釋10 倍，取10 mL 10 倍濃縮清洗液到90 mL 蒸餾水中混勻待用。配好的清洗液倒入帶蓋容器中于室溫下保存，下次試驗可以再用（注意不要污染）。

（2） 回溫。從冰箱取出試劑盒，讓試劑盒恢復至室溫后，分別取出所需要的測試孔和混合孔。

（3） 加板。第一步，加入100 μL 酶標記物（Conjugate Solution）到每個混合孔中；第二步，加入50 μL標準及樣品到相應混合孔中，混勻，用移液器轉移100 μL 到相應的測試孔；第三步，加入50 μL 抗體（Antibody Solution） 到相應的每個微孔中，注意使用一次性吸頭防止交叉污染。

（4） 反應。室溫下讓測試孔避光反應10 min。

（5） 洗板。用洗板機進行洗板，先在洗板機上設置好洗4 次板、重復3 次的程序，在緩沖液瓶裝上所對應的緩沖液，根據實際情況選擇所需要的列數，按“START”鍵進行洗板。

（6） 顯色。在每個反應孔中加入100 μL 底物溶液（Substrate Solution），室溫下反應5 min（如果顏色淺可適當延長顯色時間）。

（7） 終止。每孔中加入 100 μL 停止液 （Stop Solution）。

（8） 儀器測定。于波長450 nm 處酶標儀讀取吸光度。

1.2.4 影響因素及注意事項

（1） 試劑盒里面的混合杯存在有抗體的風險，所以建議不用試劑盒自帶的混合杯，否則會影響吸光度的結果。

（2） 洗板機的固定規格是8×12 個孔，如果做樣的時候列數沒有8 個，需要用混合杯補夠8 個孔，再進行洗板。如果洗完板發現沒有完全干，可以用吹風機進行吹干。

（3） 在每個檢測步驟進行加樣或試劑時要直接加到反應孔的底部，不能加到孔壁上，同時加完之后不能有氣泡。

（4） 在顯色時加100 μL 底物溶液的時候，這個過程需要快，如果樣品超過20 份的數量，建議用多道移液槍進行加液，以防做出來的標準不呈梯度。

（5） 對于不同批次的試劑盒，里面的反應孔和試劑不能混用。

（6） 對于用完的試劑盒和有接觸到標樣的器皿，不能直接扔掉，都需要用5%次氯酸鈉或漂白粉浸泡半天后再進行處理，備用。

2 結果與分析

2.1 樣品的檢測

該試劑盒有5 個濃度的標準品，分別為0，2.0，4.0，12.5，50.0 μg/L，于是隨機選了3 個不同的原料和2 個成品用上述所描述的方法進行檢測.

酶標儀檢測的結果見表1。

表1 酶標儀檢測的結果

結果將由酶標儀（Multiskan FC） 的軟件根據5 個標準品的吸光度來繪制ELISA 標準曲線，根據標準曲線的濃度和吸光度做出標準曲線（圖1），根據標準曲線可以計算出樣品中的黃曲霉B1具體的含量，5 個樣品的標準參照＜4 mg/L標準品來進行判定。

ELISA 標準曲線見圖1。

由表1 的吸光度和圖1 的標準曲線圖可以看出，這5 個樣品的黃曲霉毒素的結果都低于相應的允許限量，屬于陰性樣品，說明該保健食品中3 個原料和2 個成品的黃曲霉B1含量都沒有超標。

圖1 ELISA 標準曲線

樣品中黃曲霉毒素B1含量見表2。

表2 樣品中黃曲霉毒素B1 含量

2.2 回收率與精密度

2.2.1 回收率

由國家標準GB 5009.24—2016 第四法酶聯免疫法規定選取大豆分離蛋白或其他穩定的陰性樣品，根據所購買的黃曲霉試劑盒的檢出限，在陰性條件中添加3 個不同濃度水平的AFTB1標準溶液，按照說明書操作方法，用讀數儀讀數。于是選取了不同品種的產品對河北伊萊莎黃曲霉毒素B1檢測試劑盒進行驗收，測定回收率。

AFTB1 標準液回收率見表3，不同產品回收率見表4。

表3 AFTB1 標準液回收率

表4 不同產品回收率

國家標準GB 5009.22—2016 中規定，針對每個加標濃度，回收率在50%～120%允許范圍內的該批次試劑盒均可使用。綜合表3 和表4 的結果可以看出，其回收率范圍都在規定的范圍內。

2.2.2 精密度

為了符合國家標準GB 5009.22—2016 精密度的要求，于是對該試劑盒的標準品進行檢測。

檢測結果見表5。

表5 檢測結果

國家標準GB 5009.22—2016 中規定其分析結果的相應相差應不大于20%。于是，其精密度也是在允許的范圍內。

2.3 結果與分析

由表1、圖1、回收率和精密度可看出，酶聯免疫法測保健食品中的黃曲霉毒素B1具有靈敏度高、特異性強、回收率和精密度都比較高的超微量分析技術，且結果準確，可滿足標準的要求和客戶的需求。

3 結語

黃曲霉毒素雖然可怕，也存在于很多地方，但在保健食品中還是挺安全的，而測定黃曲霉的方法有多種，但酶聯免疫法一直以來都被許多科研工作者認可及推崇，該方法是一種敏感性高、特異性強、重復性好的試驗判定方法。由于該方法是一種限量方法，所以能快速檢測出保健食品中黃曲霉毒素是否在合格的標準范圍內。該方法的使用使我國在保健食品行業中測定黃曲霉毒素提高到一個新的水平[10-14]。