平潭海域夜光藻對幾種餌料藻的利用與生長

張海艷，李曉東*，楊桂琴，路瑋靜，常陽，王紫陽

( 1.福建農林大學 海洋研究院 福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州 350002)

1 引言

有害藻華（Harmful Algal Blooms, HABs）指因微藻等生物大量繁殖，導致水生生物死亡，生態系統功能被破壞，甚至威脅人類健康和生命安全的一種生態災害[1]，其頻發與人類社會發展導致的海洋富營養化與全球氣候變化有著密切的聯系[2-3]。夜光藻（Noctiluca scintillans）藻華是目前世界上分布最為廣泛的有害藻華之一，各大洋近岸都有夜光藻暴發的記錄，對當地環境與經濟造成了不同程度的負面效應[4-5]。依據是否與夜光柄胞藻（Pedinomonas noctilucae）共生，夜光藻藻華分為紅色與綠色兩種，其中綠色藻華主要分布在中東-南亞沿岸，而紅色藻華則分布在各大洋近岸海域，尤其以墨西哥灣、歐洲近海與東亞近海最為嚴重[4,6]。

夜光藻藻華同樣是我國近岸常見的有害藻華之一[7-8]，相關報道最早能夠追述到1933年，20世紀80年代之后更是每年都有夜光藻藻華暴發的記錄，其中渤海與東海近岸海域暴發最為頻繁，并有暴發區域逐年擴大的趨勢[7,9-11]。雖然在部分地區，如福建平潭與廈門，夜光藻形成的“藍眼淚”現象已成為當地知名旅游景點，但是高密度夜光藻對沿岸環境與養殖業有著明顯的不利影響，如1988年南海大鵬灣夜光藻藻華暴發，導致大量養殖魚類死亡[12-13]；2002?2003年，渤海與東海近岸夜光藻藻華導致水產養殖業損失總計超過1.3億元[8]。國外也有夜光藻藻華暴發導致珊瑚缺氧死亡的報道[14]。但是現今對夜光藻藻華的形成機制認識尚不清楚。

目前對夜光藻藻華相關研究主要集中于對藻華現象的原位分析，重點關注現場氣象、水文等條件對藻華形成與發展的影響[5,15-18]。萬艷[19]認為，較高的水溫（20.7～22.8℃）、弱風與低日照有利于平潭海域夜光藻藻華的發生；Xiang等[20]認為，鹽度低、溫度高、光照弱的環境，結合海水輻散上升的水文條件，更有利于夜光藻在海洋表層形成藻華；田達瑋等[21]發現，膠州灣夜光藻密度除與水溫呈顯著負相關之外，還與水體葉綠素濃度呈顯著正相關，說明該藻藻華和水體中食物豐度有關，這與尹翠玲等[22]對渤海灣夜光藻藻華生消過程與葉綠素濃度關系的研究結果相吻合。但目前對于夜光藻營養相關的研究較少，并且多集中在現場調查上，如Nishitani等[23]利用單細胞測序分析夜光藻食物泡中食物組成，Kitatsuji等[24]在顯微鏡下觀察夜光藻食物泡中的藻類。實驗室內定量的相關研究較少，僅有幾種常見餌料藻（如扁藻、金藻等）或者甲藻（如鏈狀裸甲藻Gymnodimium catenatum等）被探究是否能夠被夜光藻攝食或利用[25-29]，其中關于我國海洋中夜光藻對常見硅藻的攝食研究鮮見報道。

本實驗選取福建平潭海域分離的夜光藻，在幾種常見餌料藻和當地海域常見的硅藻作為單一食物來源的培養條件下，探究夜光藻增長速率的差異以及模擬海水混合對其增長速率的影響。同時探究在不同的營養鹽水平下，夜光藻和扁藻共培養時種群動態的變化，并通過擬合初步構建夜光藻的種群增長模型。實驗結果將會為東海近岸海域夜光藻暴發原因的探究提供科學依據。

2 材料與方法

2.1 藻類培養

夜光藻（N.scintillans）于2021年6月分離自福建平潭實驗區（25°37′33″N，119°47′17″E，站位見圖1），實驗室條件下滅菌海水保存。亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、微小海鏈藻（Thalassiosira minima）、小球藻（Chlorellasp.）、骨條藻（Skeletonemasp.）由福建農林大學海洋研究院藻種庫提供。以上藻種均使用f/2海水培養基[30]單種培養，海水 pH 為 8.09±0.05，鹽度為 30±1，藻類培養環境溫度為（20±1）℃，光照強度為（2 650±100）lx，光暗比為14 h∶10 h。自然海水使用0.45 μm混合纖維濾膜過濾，經121℃，25 min高溫高壓滅菌后用于藻類培養與后期實驗。玻璃器皿使用蒸餾水沖洗3遍后經121℃，25 min高溫高壓滅菌后備用，量筒與塑料器皿經超純水沖洗3遍后備用。

圖1 夜光藻采樣站位Fig.1 The sampling position of Noctiluca scintillans

2.2 不同藻類培養條件下夜光藻種群增長

實驗分別設置對照組以及實驗組，其中除夜光藻之外的6種微藻培養至指數生長后期，顯微鏡下計數后使用滅菌海水稀釋并轉移至24孔板中（實驗體積為1 mL）作為實驗組，每孔一種藻，每種藻終密度（生物量，以碳計）均為5.0×107pg/mL[31]；亞心形扁藻液氮速凍10 min滅活后解凍，作為冷凍扁藻組（與實驗組終密度相同）；等體積的滅菌海水作為對照組；解剖鏡下用吸管將夜光藻隨機加入到以上各孔板中，每孔10個。每組設置3個平行。培養條件分別設置靜置培養和模擬海水混合培養兩種培養方式。上述實驗組與對照組放置于培養環境下進行靜置培養；制備相同實驗組與對照組，將平板置于小型搖床上（120 r/min）培養，使得海水充分混勻從而模擬海水混合的情況，其他條件同靜置培養組。每天在解剖鏡下對夜光藻進行計數，持續20 d。藻類平均增長率采用Hallegraeff等[25]的公式：

式中，μ為平均增長率；t為培養時間；Nt為第t天的藻種密度；N0為實驗開始藻種密度。

2.3 不同營養鹽條件下的微藻種群動態分析

夜光藻與扁藻分別在解剖鏡和顯微鏡下計數，無菌海水稀釋后置入150 mL錐形瓶中（實驗體積為50 mL），終密度分別為 1 cells/mL 與 1×104cells/mL，實驗組設置營養鹽濃度分別為f/2、f/4、f/8、f/16、f/32海水培養基，無菌海水作為對照。每組設置3個平行，放置于藻類培養環境下進行培養，每2 d分別在顯微鏡與解剖鏡下對兩種藻類的密度進行計數，持續20 d。

2.4 夜光藻種群動態模擬

將2.3節中所得夜光藻種群動態數據導入到Ori-gin pro中進行非線性曲線擬合，初步比較后選取Boltzmann 擬合（式（2）），擬合采取 Levenherg-Marquardt優化算法，最大迭代400次。對擬合得到的結果進行進一步的分析，分別采用高斯擬合（式（3））與線性擬合（式（4），式（5））探究營養鹽水平與夜光藻種群動態參數之間的關系。

式中，y為夜光藻密度（單位：cells/mL）；D0為夜光藻初始密度（1 cells/mL）；K為環境容納量（單位：cells/mL）；t為培養時間；t0為達到K/2的培養時間；dt為時間系數；B為基線值；A為曲線下面積；w為σ置信區間；x為營養鹽稀釋系數；xc為K最大時x的取值；a,c為直線截距；b,d為直線斜率。

3 結果

3.1 不同藻類培養條件下夜光藻種群增長

如圖2所示，靜置條件下夜光藻在亞心形扁藻組中生長最為快速，在 20 d 的培養期內，夜光藻由（10±0）個上升到（205±4）個 ，平均增長率為（0.151±0.001）d?1（表1），顯著高于其他實驗組。而冷凍扁藻和骨條藻組中夜光藻在相同的時間內分別增加至（84±8）個與（86±5）個 ，平均增長率分別為（0.106±0.005）d?1與（0.108±0.003）d?1，顯著低于亞心形扁藻培養組（p＜0.01）。而在其他微藻作為唯一食物來源的情況下，夜光藻基本沒有增長，和空白對照組之間沒有顯著的差異（p＞0.05）。這表明靜置條件下，夜光藻并不能夠利用球等鞭金藻、三角褐指藻、小球藻、微小海鏈藻這4種藻作為唯一食物來源。

圖2 靜置條件下不同藻類培養的夜光藻種群增長Fig.2 Population growth of Noctiluca scintillans feeding by different algae in a standing situation

表1 不同培養條件下夜光藻種群平均增長率Table 1 Mean growth rate of Noctiluca scintillans feeding by different algal in standing and mixing simulated situation

如圖3所示，在模擬海水混合的條件下，夜光藻對不同餌料藻的利用出現了明顯的變化。雖然夜光藻在亞心形扁藻培養組的生長仍然最快，但和靜置條件下并沒有顯著的差異（p＞0.05）。冷凍亞心形扁藻培養組和骨條藻培養組與靜置條件下的沒有顯著差異（p＞0.05）。但微小海鏈藻培養組中夜光藻在20 d內上升至（153±4）個，平均增長率為（0.137±0.001）d?1，顯著高于除亞心形扁藻組之外其他實驗組（p＜0.01）。在海水混合條件下，三角褐指藻和球等鞭金藻同樣能夠作為夜光藻的食物支持其生長，這和靜置條件下有著顯著區別（p＜0.01）。這表明海水混合可能在夜光藻攝食利用浮游藻類的過程中起著重要作用。與此同時，海水混合條件下，小球藻培養組中夜光藻的種群數量依然沒有增長，這說明夜光藻可能不能夠利用小球藻。

圖3 海水混合條件下不同藻類培養的夜光藻種群增長Fig.3 Population growth of Noctiluca scintillans feeding by different algal in a seawater mixing simulated situation

3.2 不同營養鹽條件下的微藻種群動態

如圖4所示，夜光藻和亞心形扁藻的種群增長曲線在不同營養鹽條件下有著明顯的差異。在f/2培養基培養的情況下，扁藻在10 d內迅速生長至（1.38±0.09）×106cells/mL，期間平均增長速率為（0.493±0.006）d?1，顯著高于其他實驗組（p＜0.01），但是該營養鹽條件下夜光藻生長緩慢，20 d內密度由（1±0）cells/mL增長至（37±2）cells/mL，和對照組夜光藻密度（（39±6）cells/mL）之間并沒有顯著差異（p＞0.05）。隨著營養鹽濃度的下降，亞心形扁藻種群平均增長速率顯著降低（p＜0.01），低于f/2營養鹽水平的實驗組中，除f/4實驗組中扁藻最高密度達到（5.83±0.32）×105cells/mL，其余實驗組中扁藻密度都在短暫上升之后迅速回落到1×105～2×105cells/mL的水平。夜光藻則在除f/2組的其他組中逐漸占據優勢。

圖4 夜光藻和亞心形扁藻在不同營養條件下的種群增長曲線Fig.4 Population growth curves of Noctiluca scintillans and Platymonas subcordiformis under different nutritional conditions

結合擬合結果（圖5），各實驗組中夜光藻種群的動態變化較好地符合Boltzmann增長模型，各實驗組與對照組R2都在0.9以上（表2）。隨著營養鹽水平下降，夜光藻的種群增長出現先增強后減弱的趨勢，其中最大環境容納量K的峰值（（184.65±3.19）cells/mL）出現在f/8組，和實際情況下夜光藻密度的最大值（（193±10）cells/mL）并沒有顯著性的差異（p＞0.05）。擬合結果還表明，夜光藻種群增長最快時間t0與時間系數dt都隨著營養鹽水平的降低而出現降低的趨勢。進一步對Boltzmann增長模型中各參數與營養鹽稀釋系數進行相關性擬合之后，結果表明K、t0與dt與其有著較強的相關性，分別符合高斯分布、線性分布與線性分布，R2分別為 0.994 0、0.941 7、0.863 0（表3）。這表明在與亞心形扁藻的共培養體系中，夜光藻的種群增長表現為受單一因素（即營養鹽水平）影響的函數，兩種藻類表現出互相抑制的特點，其抑制能力與營養鹽水平相關，高營養鹽水平反而不利于共培養條件下夜光藻的生長。

圖5 夜光藻種群動態擬合Fig.5 Fitting of population dynamics of Noctiluca scintillans

表2 夜光藻種群動態Boltzmann擬合參數Table 2 Parameters of Boltzmann fitting on population dynamics of Noctiluca scintillans

表3 夜光藻種群動態Boltzmann擬合參數與營養鹽稀釋倍數的擬合Table 3 Fitting of dilution ratio with parameters of Boltzmann fitting on population dynamics of Noctiluca scintillans

4 討論

夜光藻生長和其食物來源有著明顯的關系，Hallegraeff等[25]發現不同藻類喂養下，夜光藻平均增長率差異（0～0.69 d?1）顯著，但不同實驗組之間餌料生物量差異較大，橫向比較較為困難。本實驗結果表明，即使在相同生物量情況下，不同微藻培養的夜光藻種群增長之間依然存在顯著差別。較于其他微藻，亞心形扁藻組中夜光藻平均增長率更高，說明該藻可能是夜光藻較好的食物。這與之前的研究結果相似[27-28,32]。相較于活細胞，冷凍死亡的亞心形扁藻投喂下的夜光藻增長率顯著下降，說明死亡藻體（或其滋養的細菌）并不是夜光藻較好的食物。海水混勻條件下的微小海鏈藻同樣能夠支持夜光藻較高的增長率，這和當前已有的海鏈藻能夠培養夜光藻的結論相符[33]，如Hallegraeff等[25]發現，偽矮海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）培養下夜光藻的平均增長率為0.16～0.23 d-1，與本實驗微小海鏈藻組夜光藻的增長率較為相似。骨條藻、球等鞭金藻與三角褐指藻在一定條件下雖然能夠維持夜光藻種群增長，但是增長率較低，且相互之間并沒有顯著的差別。這說明夜光藻在食物質量較差的情況下也能夠維持低水平的種群增長，這同樣與現有結果相吻合[28,33-34]。但Gomes等[35]發現，綠色夜光藻在三角褐指藻培養下增長率比等生物量威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）培養下的增長率要高，這與本實驗結果和之前其他的研究結果相差較大，說明混合營養的綠色夜光藻和完全異養的紅色夜光藻對食物的選擇和利用可能存在差別。

夜光藻對餌料利用上的差異有著多種解釋。Nakamura[34]認為，夜光藻在不同餌料投喂下增長率的差異與餌料藻大小（等效直徑ESD）有關，ESD小于5 μm的衣藻（Chlamydomonas parkeae）與球等鞭金藻不能支持夜光藻生長，而較大的餌料（ESD＞10 μm）投喂下夜光藻增長率較高，這同樣與本文的結果相符，亞心形扁藻與微小海鏈藻直徑均大于10 μm，而其他藻類都比較小。徐韌等[32]發現，種群增長率高的實驗組中夜光藻食物泡多而充盈，而增長率低的實驗組中夜光藻食物泡較少，認為增長率差異可能與其攝食偏好相關。但現有研究表明，雖然夜光藻對不同食物的攝食率存在顯著差異，但高攝食率并不等同于高增長率[26-27,36]，如夜光藻對海洋絲尾蟲（Uronema marinum）攝食率顯著高于其他食物，但其增長率反而是負值[27]。本實驗也發現，靜置條件下球等鞭金藻組中夜光藻在解剖鏡下能觀察到多而充盈的食物泡，但種群幾乎沒有增長，這說明夜光藻的生長和其對食物的利用更為相關。Zhang等[36]發現夜光藻在混合營養的情況下，短期攝食率和餌料生物量呈正相關，但長期更趨近于攝取營養價值更高的食物，而且營養條件充足的藻類培養下夜光藻的增長率顯著高于其在等密度的營養缺乏（氮磷不足）的同種藻類培養下的增長率。這表明食物的營養價值在很大程度上決定了夜光藻的生長。

海水混合可能對夜光藻的生長有著重要作用，模擬海水混合條件下，部分實驗組中夜光藻平均增長率顯著上升，以微小海鏈藻組最為明顯。觀察發現靜置條件下三角褐指藻和微小海鏈藻有明顯的沉淀，而海水混合條件下則處于懸浮狀態，這表明海水混合可能通過增加藻之間接觸幾率從而提高夜光藻的攝食率。觀察還發現混合條件下夜光藻更容易形成集群。集群的夜光藻能夠分泌黏性物質形成黏液網，更容易黏住食物，提高攝食率，從而獲得更高的增長率[37-38]。海水混合導致夜光藻增長率的變化可能有助于解釋平潭海域多發的藻華現象，該地區海流較強，海水混合較為強烈，為夜光藻利用海洋中硅藻等作為食物提供了良好條件。環境檢測數據表明，夜光藻藻華多發的時間（3月底至5月中旬）與該海域硅藻藻華發生的時間互相重疊，同區域可能同時出現夜光藻藻華與微小海鏈藻藻華（福建政府數據https://hyyyj.fujian.gov.cn/xxgk/tzgg/），而夜光藻藻華和前期硅藻藻華有著密切的關系[5,20,39-40]，Kitatsuji等[24]對藻華發生區的夜光藻鏡檢發現，其食物泡里面主要為角毛藻屬、海鏈藻屬等硅藻。結合本文實驗結果表明，微小海鏈藻等硅藻在平潭海域春季的大量繁殖可能是導致該海域夜光藻藻華暴發的原因之一。

近海海水富營養化是導致浮游植物大量繁殖的主要原因之一，為了探究營養鹽水平對夜光藻藻華的貢獻，本文探究了在不同營養鹽條件下，夜光藻與最佳餌料亞心形扁藻的種群動態變化。結果表明，在共培養體系下，夜光藻的種群增長與營養鹽水平有關，周成旭等[29]同樣發現，添加較低濃度營養鹽的培養基（f/40）能夠促進夜光藻-扁藻共培養體系中夜光藻的種群增長。擬合結果表明，夜光藻種群動態符合Boltzmann增長模型，其各參數都與營養鹽水平有較強的相關性，這說明無機營養水平能夠影響夜光藻種群的增長速度與環境容納量。但是作為完全異養性的藻類，夜光藻種群動態與營養鹽水平的相關性屬于間接相關，Zhang等[36]認為，夜光藻種群增長率隨餌料密度上升而上升，但同時存在邊際效應。實驗中夜光藻只有在扁藻種群增長趨近于0的時候開始增長，說明高增長率與高密度的餌料藻對夜光藻增長可能有抑制作用，這可能是與亞心形扁藻快速生長時產生他感作用有關。這表明夜光藻的種群動態可能是亞心形扁藻的營養價值與抑制能力共同作用的結果，而這兩個因素都與營養鹽水平相關，這就導致最終夜光藻種群動態表現為受營養鹽單一因素影響的函數。這種現象可能為微藻-夜光藻藻華演替提供一個可能的解釋，很多原位觀察表明，夜光藻藻華往往跟隨在硅藻等浮游植物大量繁殖之后[20,24,41]，這可能是夜光藻的生長在硅藻大量繁殖的時候受到一定的抑制，直到硅藻繁殖進入后期之后才開始大量繁殖。營養鹽的變化可能顯著改變微藻-夜光藻的種群動態關系，從而對夜光藻藻華的形成起到重要的作用，而陸源無機營養輸入可能在夜光藻藻華形成機制中有著重要的地位。

5 結論

本文探究了福建平潭海域夜光藻在幾種餌料藻與硅藻培養條件下的生長情況，結果表明不同餌料投喂下夜光藻的增長率有顯著差異，其中亞心形扁藻培養下的夜光藻生長最快。海水混合對夜光藻生長有著重要的作用，模擬混合條件下，夜光藻能夠利用微小海鏈藻等硅藻快速生長。營養鹽水平對“夜光藻-亞心形扁藻”共培養體系中兩種藻類的種群動態有著顯著的影響，其中夜光藻種群增長符合Boltzmann模型，其各項參數與營養鹽水平顯著相關。實驗結果表明，夜光藻對不同餌料藻的利用存在顯著的差異，營養鹽水平可能在夜光藻藻華形成機制中起著重要的作用。