基于“調氣解毒”理論探討肺瘤平膏調控脂質代謝逆轉腫瘤相關樹突狀細胞功能的機制研究

張曦文 欒美琪 席玉棚 鄭紅剛 花寶金

(1 中國中醫科學院廣安門醫院，北京，100053； 2 黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱，150040)

肺癌是臨床最常見的腫瘤，在我國肺癌患病率和死亡率居所有惡性腫瘤的首位[1]。脂質代謝異常與腫瘤的關系是近年興起的研究熱點與前沿科學問題。脂代謝異常能夠誘發惡性腫瘤，并且可以通過抑制抗腫瘤免疫，調節腫瘤微環境(Tumor Microenvironment，TME)形成腫瘤免疫抑制微環境，進而促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移，促進腫瘤的進展[2]。因此，重塑腫瘤微環境中免疫細胞的功能是防治腫瘤進展和轉移的關鍵。

樹突狀細胞(Dendritic Cells，DCs)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells，APC)，可以通過細胞間接觸和分泌細胞因子等方式提供免疫調節信號，高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DCs具有較強的遷移能力，成熟DCs表現為表面共刺激分子的過表達，調節細胞因子分泌，能有效激活初始T細胞，增加Th細胞(輔助性T細胞)和CTL(細胞毒性T淋巴細胞)亞群、降低調節性T細胞(Tregs)亞群表達，是機體內常見的免疫細胞。腫瘤相關樹突狀細胞Tumor-associated DCs，TDCs)是指在惡性腫瘤微環境中，表現出表型和功能異質性的樹突細胞，TDCs盡管能攝取抗原，但其抗原呈遞及T細胞活化能力受限，具有較低的免疫監視和防御功能[3-5]。越來越多的證據表明，腫瘤微環境中的DCs不僅阻礙抗腫瘤免疫，而且是多種腫瘤發生發展的積極促進劑。TDCs內氧化脂質的異常積累，導致DCs的功能障礙，脂質異常堆積的TDCs在處理加工呈遞抗原方面具有很大的缺陷，不能有效地激活T細胞抗腫瘤免疫作用，促進腫瘤的發生發展[6]。

“脂濁”既為病理產物也是致病因素，多歸屬于中醫學“痰濁”的病理范疇。全國名中醫樸炳奎教授依據多年的臨床經驗并且結合現代醫學藥物篩選結果研制了具有確切肺癌療效的肺瘤平膏。肺瘤平膏全方由四類藥物組成，包括扶正藥物、解毒藥物、化痰藥物和活血藥物，具有益氣養陰、化痰散結、解毒活血的功效。肺瘤平膏中扶正藥物可通過“扶正”達到“調氣”之功，恢復和維持機體生理之氣的正常輸布，使其陰陽平和，機體正氣充足；化痰活血、解毒散結之品共奏“解毒”之功，使痰凝、血瘀、癌毒之邪消減，驅邪外出。

本實驗將體外模擬腫瘤微環境，構建TDCs模型，探究肺瘤平膏改善脂質堆積，逆轉TDCs功能的效應機制，探析中醫“調氣解毒”與改善肺癌免疫微環境的關聯性，豐富并充實中醫腫瘤理論體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物 Lewis肺癌細胞株(購自國家實驗細胞資源共享平臺北京總部)；4周齡的C57BL/6雄性小鼠，體質量(14±1)g，購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國中醫科學院廣安門醫院清潔級動物實驗中心[許可證號：SYXK(京)2005-0001]。

1.1.2 藥物 肺瘤平膏(中國中醫科學院廣安門醫院院內制劑室，批號：20171211)。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI 1640(Hyclone公司，美國，貨號：SV30809.01)；Fetal Bovine Serum(胎牛血清)(Gibco公司，美國，貨號：10099141C)；0.25%Trypsin+0.02%EDTA胰酶消化液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司，貨號：GNM-25200)；二甲基亞砜(Sigma公司，美國，貨號：DMSO D2650)；青鏈霉素雙抗(Hyclone公司，美國，貨號：SV30010)；磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)(Hyclone公司，美國，貨號：SH30256.01B)；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子蛋白(Recombinant Mouse GM-CSF Protein)(R&D公司，美國，貨號：415-ML-020)；重組小鼠白介素-4蛋白(Recombinant Mouse IL-4 Protein)(R&D公司，美國，貨號：404-ML-025)；10X濃縮裂解緩沖液Lysing Buffer 10X Concentrate 100 mL(BD公司，美國，貨號：555899)中性脂滴熒光探針BODIPY 493/503(Thermo Fisher公司，美國，貨號：D3922)；流式細胞技術使用抗體：APC Hamster Anti-Mouse CD11c 0.1 mg(BD公司，美國，批號：550261)；APC Hamster Anti-Mouse CD11c 0.1 mg(BD公司，美國，貨號：550261)；PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse I-A/I-E 50 μg(BD公司，美國，批號：562363)；PE Rat Anti-Mouse CD86 0.2 mg(BD公司，美國，批號：553692，)；FITC(Fluorescein isothiocyanate)Hamster Anti-Mouse CD80 0.1 mg(BD公司，美國，批號：561954)；APC Hamster IgG1，λ1 Isotype Control 0.1 mg(BD公司，美國，批號：553956，)；PerCP-CyTM5.5 Rat IgG2b，κ Isotype Control 0.1 mg(BD公司，美國，批號：550764)；PE Rat IgG2a，κ Isotype Control 0.1 mg(BD公司，美國，批號：553930)；FITC Hamster IgG2 κ Isotype Control 0.25 mg(BD公司，美國，批號：550056)；PerCP Armenian Hamster Anti-Mouse CD3e(BD公司，美國，批號：553067，)；FITC Rat Anti-Mouse CD4(BD公司，美國，批號：553046)；PE Rat Anti-Mouse CD8a(BD公司，美國，批號：553032)；APC Rat Anti-Mouse CD25(BD公司，美國，批號：557192)；PE Rat anti-Mouse Foxp3(BD公司，美國，批號：563101)；PE Rat IgG2a，κ Isotype Control(BD公司，美國，批號：553930)；轉錄因子緩沖液Transcription Factor Buffer Set(BD公司，美國，貨號：562574)；多因子檢測試劑盒(eBioscience公司，美國，批號：PPX-05；LOT.222242-000，)；TGF-β1檢測試劑盒(eBioscience公司，美國，批號：BMS608-4；LOT.218843-005)；動物脾臟組織淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：LTS1092PK)；FACS Calibur流式細胞儀FACS Calibur Flow Cytometer System(BD公司，美國，型號：FACS Calibur)；多功能酶標儀(BioTek公司，美國，型號：Synergy HT)；Luminex 200多因子檢測儀(Luminex公司，美國，型號：Luminex200)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 肺瘤平膏含藥血清配置 成人按照體質量60 kg計算，肺瘤平膏正常使用劑量為20 g/次，2次/d。根據成人與大鼠的換算系數為6.3，則大鼠等效劑量20 g/60 kg×6.3=2.1 g/kg，中劑量為等效劑量的2倍，大鼠中劑量為4.2 g/kg。大鼠體質量按照0.20 kg計算，則每次用藥劑量為4.2 g/kg×0.20 kg=0.84 g，按照單次灌胃體積為2 mL計算，則肺瘤平膏濃度需調整為0.42 g/mL，空白組(NRS)采取生理鹽水0.2 mL灌胃。將20只Wistar大鼠，隨機分為肺瘤平膏(FLP)組和空白組，每組10只。適應性飼養24 h后，2次/d進行灌胃，連續給藥3 d，第3天晚上禁食不禁水，第4天晨起給藥1次，1 h后，麻醉，腹主動脈取血，靜置離心后完成肺瘤平膏組及空白組含藥血清配置。

1.2.1.2 TDCs的分離、誘導培養及鑒定 取4周齡雄性C57BL/6小鼠脫頸處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，進行骨髓腔沖洗，將骨髓細胞沖入15 mL離心管中，1 300 r/min，離心半徑30 cm，離心5 min后充分裂解紅細胞，加入細胞因子的完全培養基重懸培養(完全培養基配比：RPMI1640培養液、10%FBS、1%青鏈霉素雙抗、Recombinant Mouse GM-CSF終濃度40 ng/mL，Recombinant Mouse IL-4終濃度20 ng/mL)，每2天半量換液至第6天，收集并流式細胞儀檢測細胞分子表面標記CD11c表達，鑒定獲得小鼠骨髓源DCs，20%Lewis肺癌細胞培養上清，進行誘導培養，即獲得TDCs。

1.2.1.3 構建TDCs與T細胞共培養模型 制備BALB/c小鼠脾臟單細胞懸液，并運用淋巴細胞液分離液進行T細胞分離，與TDCs共培養72 h后獲得TDCs-T細胞共培養模型。

1.2.2 干預方法 本實驗共分2組：空白血清對照組(Control對照組)：建立TDCs培養體系后，按10%的濃度加入空白血清；肺瘤平膏含藥血清組(FLP組)：建立TDCs培養體系后，按10%的濃度加入肺瘤平膏含藥血清；以上分組以106細胞培養于細胞培養十二孔板中，5%CO237 ℃細胞培養箱中培養24 h，觀察肺瘤平膏含藥血清對腫瘤相關樹突狀表型影響、白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌的影響。通過FLP組及對照組干預后的TDCs與T細胞共培養，觀察肺瘤平膏含藥血清對淋巴細胞增殖及T細胞亞群表達的影響。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導TDCs中脂質的影響 小鼠骨髓源DCs的分離、培養，建立體外TDCs培養模型，肺瘤平膏含藥血清及空白血清干預培養，通過BODIPY 493/503染色后流式細胞儀檢測，使用Flow Jo 10.4軟件進行流式數據分析。

1.2.3.2 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導腫瘤相關樹突狀表型的影響 小鼠骨髓源DCs的分離、培養，建立體外TDCs培養模型，肺瘤平膏含藥血清及空白血清干預培養，通過流式細胞儀檢測肺瘤平膏含藥血清對TDCs細胞表面分子CD11c、主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)-Ⅱ、CD80、CD86的表達，使用軟件Flow Jo 10.4對TDCs表型進行分析。

1.2.3.3 肺瘤平膏含藥血清調節TDCs細胞因子白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌(基于Luminex技術定量檢測TDCs細胞因子白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌) 收集上述實驗培養上清，通過多因子分析儀(Luminex 200)檢測白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌并進行分析。

1.2.3.4 肺瘤平膏含藥血清調節TDCs對混合淋巴細胞增殖的影響(CCK8檢測混合淋巴細胞增殖情況) 分離、培養小鼠骨髓源DCs，建立體外TDCs培養模型，肺瘤平膏含藥血清及空白血清干預培養；取脫頸處死BALB/c小鼠，分離獲得小鼠脾淋巴細胞；將TDCs與淋巴細胞按照1∶10共培養72 h，CCK8試劑盒檢測混合細胞增殖。

1.2.3.5 肺瘤平膏含藥血清調節TDCs影響Th細胞、CTL細胞和Tregs細胞表型的影響 分離、培養小鼠骨髓源DCs，建立體外腫瘤相關DCs培養模型，肺瘤平膏含藥血清及空白血清干預培養；取脫頸處死BALB/c小鼠，分離獲得小鼠脾淋巴細胞；將TDCs與淋巴細胞按照1∶10共培養72 h，流式細胞儀檢測CD3e、CD4、CD8a、CD25、叉頭框蛋白3(Forkhead box protein 3，Foxp3)細胞分子標志物表達。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測小鼠骨髓源DCs表面分子的表達 為觀察小鼠骨髓源DCs表面分子CD11c表達情況，應用流式細胞術對獲得到細胞懸液進行CD11c APC表面標記染色，單染CD11c同型抗體流式圈門后，CD11c陽性比例為76.5%。因此，小鼠骨髓源單核細胞經體外細胞因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF)和白細胞介素-4誘導培養后，得到CD11c+DCs的純度為76.5%，可用于接下來的實驗研究。見圖1。

圖1 流式細胞法檢測小鼠骨髓來源單核細胞誘導DCs的純度

2.2 肺瘤平膏含藥血清對TDCs脂質的影響 結果表明，肺瘤平膏含藥血清作用于TDCs，脂質含量小于空白血清對照組，FLP組>對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1、圖2。

表1 FLP含藥血清對TDCs脂質含量表達的作用(平均熒光強度,

圖2 FLP含藥血清對TDCs脂質含量表達的作用

2.3 肺瘤平膏含藥血清對TDCs表型的影響 結果表明：肺瘤平膏含藥血清干預后，MCH-Ⅱ、CD80、CD86表達水平均有一定程度的提高，其中CD80、CD86表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，MCH-Ⅱ細胞分子的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖3～6。

表2 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導TDCs表型的影響

圖3 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導TDCs MCH-Ⅱ表型的影響

圖4 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導TDCs CD80表型的影響

圖5 肺瘤平膏含藥血清對體外誘導TDCs CD86表型的影響

圖6 肺瘤平膏含藥血清對TDCs表型的影響

2.4 肺瘤平膏含藥血清調節TDCs細胞因子白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌 結果表明：肺瘤平膏含藥血清干預后，白細胞介素-12p70、γ干擾素具有一定程度的提高(FLP組>對照組)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖7。

表3 FLP含藥血清對TDCs分泌白細胞介素-12p70、γ干擾素表達的影響

圖7 FLP含藥血清對TDCs分泌白細胞介素-12p70、γ干擾素表達的影響

2.5 肺瘤平膏含藥血清對TDCs調節混合淋巴細胞增殖和T細胞亞群的影響

2.5.1 肺瘤平膏含藥血清對混合淋巴細胞反應中細胞增殖的影響 結果顯示，肺瘤平膏含藥血清能夠一定程度地影響細胞的CCK8 OD值結果，說明肺瘤平膏對能夠一定程度地提高混合細胞的增殖能力。結果表明，肺瘤平膏含藥血清刺激混合淋巴細胞的增殖能力較空白血清組較強。見圖8。

圖8 肺瘤平膏對混合淋巴細胞培養細胞增殖的影響

2.5.2 肺瘤平膏含藥血清調節TDCs影響Th細胞和CTL細胞亞群 結果表明，淋巴細胞培養后的混合細胞中后，與空白血清組比較，肺瘤平膏含藥血清干預可以明顯提高T細胞中CD4+、CD8+表達比例，差異有統計學意義(P<0.05)。FLP含藥血清可以提高T細胞中Th細胞和CTL細胞亞群的分化。見表4、圖9～10。

表4 FLP含藥血清調節TDCs對CD4+、CD8+T細胞表達的影響

圖9 FLP含藥血清調節TDCs對CD4+、CD8+T細胞表達的影響

圖10 FLP含藥血清調節TDCs對CD4+、CD8+T細胞表達的影響

2.5.3 肺瘤平膏含藥血清作用于TDCs影響Tregs細胞表型的表達 結果表明：肺瘤平膏含藥血清干預后，Tregs細胞表達百分比具有一定程度的下降(FLP組<對照組)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5、圖11～12。

表5 FLP含藥血清調節TDCs對Tregs表達的影響

圖11 FLP含藥血清調節TDCs對Tregs表達的影響

圖12 FLP含藥血清調節TDCs對Tregs表達的影響

3 討論

肺癌屬于中醫學癌病范疇，但并沒有具體的病名，根據其臨床的具體表現，可以將肺癌歸屬于“肺積”“息賁”“咳嗽”等范疇。《難經·論五臟積病》記載：“肺之積，名日息賁，在右脅下，覆大如杯，久不已，令人灑淅寒熱，喘咳，發肺壅。”《景岳全書·虛損》篇中對于肺癌的相似論述，曰：“勞嗽，聲啞，聲不能出或喘息氣促者，此肺臟敗也，必死。”肺癌的發病基礎為“正虛氣滯，邪毒內戀”，氣機升降失調、正氣虛損導致痰凝、血瘀內生，釀生癌毒是肺癌發生及進展的關鍵病機，可認為“調氣解毒”是肺癌的防治準則。

“全國名中醫”樸炳奎教授，根據多年臨床經驗，結合現代藥理學研究結果，研制出肺癌治療的有效方劑肺瘤平膏，全方選用益氣養陰藥物：黃芪、西洋參、沙參、麥冬等；清熱解毒藥物：拳參、敗醬草、白花蛇舌草、仙鶴草等；化痰活血藥物：桔梗、川貝母、杏仁、桃仁等，共奏調氣解毒、標本兼治之功。

腫瘤微環境通過多種作用機制，形成機體免疫系統抑制網絡，導致多種機體免疫細胞功能障礙，抗腫瘤免疫能力下降，形成復雜的腫瘤免疫逃逸。DCs作為機體最重要的APC，在抗腫瘤免疫中具有重要的調節作用。腫瘤免疫抑制微環境也通過多種機制抑制DCs的分化和活化成熟，抑制機體抗腫瘤免疫應答的啟動，使腫瘤局部募集的DCs表現為異常分化的未成熟表型，細胞呈遞腫瘤抗原的能力減弱，降低免疫監視和防御功能，促進腫瘤細胞的生長和轉移[7]。

近年來研究發現，TDCs內脂質的異常堆積也是影響TDCs的功能的關鍵因素。隨著腫瘤相關刺激的暴露，細胞內脂肪在DCs中積聚[8]。研究報道稱，氧化脂質的積累，特別是三酰甘油的積累，會引起DCs的功能障礙，縮短細胞的壽命[9-11]。研究顯示，未成熟及功能受到了系統性地干擾的TDCs，具體表現為細胞表面共刺激分子表達量的下降、白細胞介素-12等細胞因子分泌減少、細胞吞噬抗原能力減弱、T細胞提呈功能下降等[12-16]。

本研究通過對體外模擬培養的TDCs中的脂質進行流式檢測，結果發現，肺瘤平膏含藥血清作用后的TDCs，脂質含量小于空白血清對照組(FLP組>對照組)，差異有統計學意義(P<0.01)，證明肺瘤平膏能夠改善DCs內的脂質積累，對DCs的功能產生正向調控。DCs的表面共刺激分子，MHC-Ⅱ類分子在免疫應答過程中表達，被看成是DCs抗原遞呈能力的標志。CD80(B7-1)、CD86(B7-2)表達在成熟的DCs細胞表面，與表達在T淋巴細胞上的配體CD28、CTLA-4結合后提供協同信號，導致T淋巴細胞活化。因此，本實驗通過流式驗證DCs表面分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表達，評估肺瘤平膏含藥血清作用后的TDCs的抗原呈遞能力。本實驗研究結果發現，肺瘤平膏含藥血清干預后，MCH-Ⅱ、CD80、CD86表達水平均有一定程度的提高，其中CD80、CD86表達水平明顯高于空白血清組(P<0.05)，證明肺瘤平膏能夠有效地促進TDCs細胞的成熟，改善細胞的抗原呈遞能力，促進T細胞激活。

DCs能夠激活淋巴細胞的增殖和活化[17]。本研究采用負載抗原的TDCs與淋巴細胞共培養的方式，研究肺瘤平膏調控TDCs對混合淋巴細胞增殖和T細胞亞群活化的影響。結果顯示：共培養細胞后，肺瘤平膏含藥血清作用后的混合細胞增殖能力較空白血清增強。通過研究肺瘤平膏對T細胞亞群的影響，結果發現，與空白血清組比較，肺瘤平膏含藥血清干預可以明顯提高T細胞中CD4+、CD8+表達比例(P<0.05)，降低Tregs的表達。由此可知，FLP含藥血清可以促進Th細胞和CTL亞群、抑制Tregs亞群的活化。

研究發現，高水平的細胞因子白細胞介素-12、γ干擾素可以有效地激活T細胞增殖活化[18]，腫瘤免疫抑制微環境對TDCs的細胞因子分泌具有負調節作用。本研究發現，肺瘤平膏含藥血清干預后，白細胞介素-12p70、γ干擾素具有一定程度的提高(FLP組>對照組)，差異有統計學意義(P<0.05)，可以印證對混合淋巴細胞增殖活化作用的改善或是與促進白細胞介素-12p70、γ干擾素分泌相關。

綜上所述，在腫瘤免疫微環境中，肺瘤平膏含藥血清能夠有效地降低TDCs中的脂質堆積，促進TDCs的成熟和抗原呈遞能力，促進白細胞介素-12p70、γ干擾素的分泌，改善激活混合淋巴細胞增殖和T細胞亞群活化功能，增強腫瘤免疫功能。揭示了中醫藥“調氣解毒”代表方劑肺瘤平膏具有改善肺癌免疫抑制微環境的作用，進而發揮中醫藥腫瘤免疫調節作用，抑制腫瘤的發生發展，豐富并充實中醫藥腫瘤防治理論。