基于網絡藥理學的玉屏風散和褪黑素對免疫系統影響的作用機制研究

王華星 趙 凱 高 雪 李榮欣 許筱穎

(1 北京中醫藥大學中醫學院，北京，102488； 2 首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069)

玉屏風散和褪黑素的臨床使用在調節免疫系統中具有重要的意義。本研究使用網絡藥理學與動物實驗聯合的方法，以網絡藥理學全面檢索褪黑素及玉屏風散可能作用于機體的免疫相關靶點及通路，以動物實驗研究氣溫驟升驟降條件下，玉屏風散與褪黑素對老年小鼠白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的預防性干預作用，以更好地指導臨床精準用藥及二者的聯合使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 84只雄性8周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2016-0011。實驗在北京中醫藥大學中醫基礎理論實驗室進行。購入動物后，將昆明小鼠飼養在聚乙烯動物飼養箱中適應性飼養1周。小鼠均可自由攝食攝水。飼料為鼠全價維持飼料。動物房溫度(20±2)℃，相對濕度50%，自然光照，動物倫理批號：BUCM-4-2018091101-3049。

1.1.2 藥物 生黃芪、炒白術和防風均購置于北京中醫藥大學國醫堂門診部。褪黑素(上海生工生物工程股份有限公司，批號：A600605-0005)。

1.1.3 試劑與儀器 D-半乳糖(上海麥克林生化科技有限公司，批號：D810319)；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫試劑盒(北京瑞格博科技發展有限公司，批號:20190629.60013M；20190629.60023M；20190629.60080H)；人工智能氣候模擬箱(寧波江南儀器廠，型號：RXZ-500D)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司，芬蘭，型號：Thermo Multiskan MK3)；全自動生化分析儀(Beckmancoulter公司，美國，型號：UniCel DxC 600 Synchron)；洗板機(長春賽諾邁德醫學技術有限責任公司，型號：Sunostik Sar-520B);低溫高速離心機(Beckman公司，美國，型號：GS-15R)；搖床(上海蘇坤實業有限公司，型號：SKY-200B)；漩渦儀(無錫天力機械制造有限公司，型號：TL96-A)。

1.2 方法

1.2.1 玉屏風散、褪黑素潛在靶點及共同潛在靶點的收集與篩選 依據《網絡藥理學評價方法指南》[1]，在中醫藥生物信息學數據庫SymMap(https://www.symmap.org/)中檢索“黃芪”“白術”“防風”，P值設置為0.05，獲得Targets列表。在韋恩圖計算繪制工具中合并并保留唯一值，即為玉屏風散的潛在靶點。在比較毒理基因組學數據庫[2](Comparative Toxicogenomics Database，CTD,http://ctdbase.org/)選擇關鍵詞“化學成分”(Chemicals)，檢索“褪黑素”(Melatonin)，得到褪黑素的潛在作用靶點。將玉屏風散和褪黑素的靶點在韋恩圖計算繪制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中取交集，獲得玉屏風散-褪黑素的共同潛在靶點。

1.2.2 玉屏風散、褪黑素潛在靶點的基因本體(Gene Ontology,GO)免疫系統過程富集分析 將玉屏風散和褪黑素的潛在靶點分別導入Cytoscape 3.7.2軟件及其中的cytoHubba插件、ClueGO插件[3-5]，使用GO分析中的免疫系統過程(Immune System Process，ISP)富集分析。

1.2.3 玉屏風散、褪黑素潛在關鍵免疫靶點篩選 提取各ISP通路所涉及的相關靶點，作為玉屏風散、褪黑素的免疫通路相關靶點，并取其中ISP通路占比大于平均值者，分別作為玉屏風散和褪黑素的關鍵免疫靶點。選擇物種“Homo Sapiens”，設置P<0.05，Kappa值為默認的0.4，分別得到玉屏風散、褪黑素所涉及的免疫通路，和這些免疫通路中的相關靶點，進行可視化處理和拓撲學分析，并篩選出關鍵免疫靶點。

1.2.4 關鍵免疫靶點蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡的構建 將2組關鍵免疫靶點分別輸入PPI網絡功能富集分析數據庫STRING(Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis，https://string-db.org/)[6]，在“生物體”(Organism)中選擇“人類”(Homo Sapiens)，得到2組關鍵免疫靶點分別構建的PPI網絡，進行可視化處理。并使用Cytoscape基于節點度(Degree)、介數中心性(Betweenness Centrality，BC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)對該網絡進行拓撲學分析。

1.2.5 京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 將2組關鍵免疫靶點分別輸入ClueGO并進行KEGG信號通路富集分析。選擇物種“Homo Sapiens”，設置P<0.05，為了使結果分組顯示更為清晰，設置Kappa值為0.6。

1.2.6 玉屏風散與褪黑素免疫功能分子機制的異同比較 將玉屏風散與褪黑素的免疫關鍵靶點進行比較，得到二者之間的異同。將玉屏風散與褪黑素的GO ISP通路、KEGG通路進行比較，得到二者免疫相關通路的異同。

1.2.7 溶液制備 中藥復方參照出處《醫方類聚》及現代常用組方，玉屏風散：生黃芪、炒白術、防風[7]。將上述藥材經過煎煮濃縮為含有生藥1 g/mL的藥液，分別灌裝后放4 ℃冰箱保存。

1.2.8 分組與模型制備 將適應性飼養后的小鼠用隨機數字表法隨機分組。按氣溫處理因素分為常溫對照、氣溫驟降、氣溫驟升3項。

對每種氣溫處理，均以藥物干預作為研究因素，即玉屏風散(Y)、褪黑素(T)，每個因素各取2個水平，將2個因素交叉組合，使每個氣溫項下均得到4個觀察組。2種藥物均不用的組別以生理鹽水灌胃作為對照組。

共得到3×4=12組，每組7只。每組具體編號為：C、CY、CT、CYT；L、LY、LT、LYT；H、HY、HT、HYT。

按組別將相應受試藥物給小鼠灌胃6周。將玉屏風散煎劑分別給玉屏風散組(編號CY、LY、HY組)的小鼠按每次0.1 mL/(10 g)，1次/d灌胃，每次灌胃0.4 mL；褪黑素用生理鹽水稀釋后給褪黑素組(編號CT、LT、HT組)按每次0.15 mg/(10 g)，1次/d小鼠灌胃，灌胃0.2 mL/次；將上述劑量的玉屏風散煎劑與褪黑素混合給玉屏風散+褪黑素組(編號CYT、LYT、HYT組)的小鼠灌胃，每次灌胃0.6 mL的混合藥液；對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

受試藥物灌胃結束后，將小鼠按組別依次放入預先調試好的人工氣候模擬箱中進行氣溫干預。氣溫驟降從30 ℃在30 min內下降到8 ℃，氣溫驟升從8 ℃在30 min內上升至30 ℃，相對濕度保持自然條件濕度，光照時間參照自然光照，持續10 h。

1.2.9 IL-1β、IL-6、TNF-α檢測 試驗干預完成后，所有小鼠禁食禁水12 h后進行摘眼球取血1 mL左右，將血液用低溫高速離心機以4 ℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm的條件下離心15 min，分離上清液，保存于-80 ℃冰箱。小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α使用酶聯免疫吸附測定法檢測，經過洗液配制、孵育、洗液洗孔、顯色等步驟，用酶標儀讀取數值。

2 結果

2.1 玉屏風散、褪黑素潛在靶點及共同潛在靶點 從SymMap數據庫中共檢索到黃芪、白術、防風可能的作用靶點240個、46個、137個，將此三味中藥的靶點去重后得到玉屏風散的潛在作用靶點共計339個。從CTD數據庫中檢索到的褪黑素的潛在靶點325個。將玉屏風散和褪黑素的靶點用韋恩圖處理并取交集之后，得到二者共同的潛在作用靶點85個。見圖1。

圖1 玉屏風散和褪黑素的共同潛在靶點預測

2.2 玉屏風散、褪黑素潛在靶點的GO免疫系統過程富集分析 將玉屏風散的339個潛在靶點和褪黑素的325個潛在靶點進行富集分析，結果顯示，玉屏風散涉及免疫過程11條(P<0.05)，共分為了6類(Kappa=0.4)。見圖2～3。其中白細胞分化(Leukocyte Differentiation)、T細胞活化(T Cell Activation)、淋巴細胞增殖(Lymphocyte Proliferation)、淋巴細胞增殖的調控(Regulation of Lymphocyte Proliferation)、T細胞增殖(T Cell Proliferation)等通路的基因占比位居前列；而白細胞遷移的正向調控(Positive Regulation of Leukocyte Migration)、未成熟T細胞的增殖(Immature T Cell Proliferation)、未成熟T細胞增殖的調控(Regulation of Immature T Cell Proliferation)、抗原刺激下慢性炎癥反應的調控(Regulation of Chronic Inflammatory Response to Antigenic Stimulus)是其相對于褪黑素而言獨有的免疫系統過程。褪黑素涉及免疫過程32條(P<0.05)，共分為了11類(Kappa=0.4)。見圖4～5。其中造血功能(Hemopoiesis)、白細胞分化(Leukocyte Differentiation)、T細胞活化(T Cell Activation)、骨髓細胞分化(Myeloid Cell Differentiation)、骨髓白細胞分化(Myeloid Leukocyte Differentiation)等通路的基因占比位居前列；而造血功能(Hemopoiesis)、骨髓細胞分化(Myeloid Cell Differentiation)、骨髓白細胞分化(Myeloid Leukocyte Differentiation)、T細胞活化的調控(Regulation of T Cell Activation)等通路是其相對于玉屏風散而言特有的免疫系統過程。

圖2 玉屏風散GO免疫系統過程富集分析結果

圖3 玉屏風散GO免疫系統過程富集分析的分類

圖4 褪黑素GO免疫系統過程富集分析結果

圖5 褪黑素GO免疫系統過程富集的分類

2.3 玉屏風散、褪黑素的關鍵免疫靶點 提取上述ISP通路所涉及全部靶點，得到玉屏風散、褪黑素的免疫通路相關靶點分別有62個、84個，靶點涉及的ISP通路數目(通路數)平均值分別為3.097/11條、7.143/32條。將ISP通路占比高于平均值的靶點分別作為玉屏風散、褪黑素的關鍵免疫靶點，得到關鍵免疫靶點20個、32個。其中玉屏風散的免疫靶點中通路占比最高的依次為BMP4、TGFB1、IL1B、CDKN2A、ERBB2等，褪黑素中通路占比最高的依次為IL4、TGFB1、IFNG、HMGB1、RORA等，二者共有的關鍵免疫靶點包括TGFB1、IL1B、IL4、IL6、IL10、CASP3和BCL2。

2.4 玉屏風散、褪黑素關鍵免疫靶點的PPI網絡 由STRING分析得知，玉屏風散的20個關鍵免疫靶點共產生了82條邊，平均節點度8.2，平均局部聚類系數0.742，P<0.01。見圖6。褪黑素的32個關鍵免疫靶點共產生了251條邊，平均節點度15.7，平均局部聚類系數0.778，P<0.01。二者均具有顯著的差異。見圖7。

圖6 玉屏風散20個關鍵免疫靶點的PPI網絡

圖7 褪黑素32個關鍵免疫靶點的PPI網絡

由Cytoscape分析得知，玉屏風散得到19個(其中一個靶點未與其他靶點產生聯系)關鍵免疫靶點的Degree、BC、CC的平均值分別為8.63、0.032、0.67，最高者分別為TP53、IL6、TP53；褪黑素的31個(其中一個靶點未與其他靶點產生聯系)關鍵免疫靶點的Degree、BC、CC的平均值分別為16.19、0.017、0.70，最高者分別為TNF、STAT3、TNF。見表1～2。

表1 玉屏風散19關鍵免疫靶點PPI網絡的拓撲分析

表2 褪黑素31關鍵免疫靶點PPI網絡的拓撲分析

2.5 玉屏風散、褪黑素關鍵免疫靶點的KEGG通路富集分析 玉屏風散、褪黑素關鍵免疫靶點的KEGG通路富集分析結果顯示，玉屏風散涉及KEGG通路33條(P<0.05)，共分為了7類(Kappa=0.6)。見圖8～9。其中結核病(Tuberculosis)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE通路(AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications)、瘧疾(Malaria)、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)等通路的基因占比位居前列；而胰腺癌(Pancreatic Cancer)、非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、慢性粒細胞性白血病(Chronic Myeloid Leukemia)等是其相對于褪黑素所獨有的通路。褪黑素關鍵免疫靶點的KEGG通路61條(P<0.05)，共分為了11類(Kappa=0.4)。見圖10～11。其中沙門氏菌感染(Salmonella Infection)、結核病(Tuberculosis)、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)(Chagas Disease，American Trypanosomiasis)、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)等通路的基因占比位居前列；而沙門氏菌感染(Salmonella Infection)、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)(Chagas Disease，American Trypanosomiasis)、Th17細胞分化(Th17 Cell Differentiation)、乙型肝炎(Hepatitis B)等則是其相對于玉屏風散而言特有的通路。

圖8 玉屏風散KEGG通路富集的通路及分類

圖9 玉屏風散KEGG通路富集的分類

圖10 褪黑素KEGG通路富集的通路

圖11 褪黑素KEGG通路富集的分類

2.6 不同氣溫、藥物干預后對小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的影響 在氣溫驟升和驟降條件下，玉屏風散組、玉屏風散+褪黑素組血清IL-6上升，褪黑素組血清IL-6含量下降，但其差異無統計學意義(P>0.05)；在常溫、氣溫驟升、氣溫驟降條件下，玉屏風散組、玉屏風散+褪黑素組可以使血清IL-1β升高，褪黑素組則顯示IL-1β含量下降，而且其差異均有統計學意義(均P<0.01)；在常溫條件下，與對照組比較，玉屏風散組、褪黑素組、玉屏風散+褪黑素組血清TNF-α均下降，其中褪黑素組下降最為明顯，其差異有統計學意義(P<0.01)；氣溫驟降條件下，玉屏風散組、玉屏風散+褪黑素組小鼠血清TNF-α上升，但其差異無統計學意義(P>0.05)。氣溫驟升條件下，玉屏風散組血清TNF-α上升，玉屏風散+褪黑素組小鼠血清TNF-α下降，與對照組比較，其差異無統計學意義(P>0.05)。在氣溫驟升時，褪黑素組小鼠血清TNF-α下降明顯，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

免疫系統是人體維持內環境平衡與應對外界刺激的重要組分之一，當免疫系統在內因或外因的作用下失去平衡時，相關疾病將涉及感染、自身免疫性疾病、腫瘤、其他免疫異常、繼發的其他系統紊亂等問題[8-13]。玉屏風散和褪黑素調節免疫系統的功能已被大量的臨床和實驗室研究所證實，但二者均涉及復雜的調控網絡，這也為二者在臨床不同情境下的取舍，乃至聯合應用帶來了相當多的困難[14-18]。

相對于玉屏風散而言，褪黑素的相關研究主要集中在國外，這些研究的起步更早，數量也更多，這意味著我們所知的相關調控網絡也更為復雜[19]。故本研究中，在同一網絡藥理學檢索參數的條件下，檢索到的褪黑素相關通路和靶點遠多于玉屏風散的重要原因。此外，褪黑素相關靶點、通路的多元性，一方面意味著它具有更廣泛的潛在臨床使用價值，另一方面，也意味著在使用它治療特定的疾病如哮喘、類風濕性關節炎、多發性硬化時，可能產生更多的不良反應，任何炎癥都可能是它的禁忌證[20-23]。

表3 不同氣溫、藥物干預后小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量

相對于褪黑素而言，玉屏風散作用機制的理解則有其特殊的麻煩。因為對于玉屏風散這樣的中藥復方而言，相當多的研究都是按照“臨床發現療效→動物實驗或臨床試驗的指標觀察→相應分子機制的研究”的順序進行的，其復方內部的邏輯關系并不清晰。而網絡藥理學這一能夠快速、系統地檢索藥物作用的靶點、相關通路，并進行系統分析的方法，為理清上述機制開辟了一條可行的科研思路。

綜上所述，玉屏風散和褪黑素均可通過復雜的通路及靶點調控免疫系統的運行，二者針對的通路較為一致，而靶點卻不同。玉屏風散在常溫和氣溫驟降時對IL-1β表現出促炎作用，而褪黑素則在常溫和氣溫驟升時對TNF-α表現出抗炎作用。本研究提示了氣溫變化對免疫干預的影響的可能性；結合文獻檢索、實驗結果和中醫理論，建議在氣溫驟變時，對免疫功能低下的人群，可以應用玉屏風散聯合褪黑素預防疾病的發生。此外，考慮到玉屏風散和褪黑素在網絡藥理學中檢索到的免疫通路較為一致，但實驗結果卻表明它們對IL-1β和TNF-α的調節不同，建議各網絡藥理學相關的數據庫，可以考慮在從一手文獻中提取資料時，不僅提取有效成分、靶點、通路之間的相關關系，而且同時保留這種關系的作用方向(正調控、負調控、雙向調控等)，以便為后續的數據分析提供更精確的支持。