寬胸理肺湯合三子養親湯改善慢阻肺的實驗研究

薛經緯 陶智會 李 勇 朱 毅

(1 上海市嘉定區中醫醫院內一科，上海,201800； 2 上海中醫藥大學附屬第七人民醫院全科，上海,200137； 3 上海市中醫醫院脾胃病科，上海,200071)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD)是以不完全可逆的氣流受限為主要特征，進行性加重、可治療、可預防的呼吸系統常見疾病。由于COPD早期診斷較少，直至確診時，患者病情嚴重，給患者生命質量、肺功能和心理狀態均造成極大的危害。現階段臨床常采用的常規治療措施以及藥物，通常僅可以使癥狀得到改善，使急性加重的程度與次數得到緩解，卻無法從根本上遏制肺功能的惡化，同時也出現了一些濫用激素以及抗生素的現象，引發了患者產生耐藥性、免疫力下降、菌群構成失調以及嚴重的腸道不良反應等方面的問題。隨著研究的不斷深入，中醫在COPD治療方面已取得了明顯的進展，相關研究表明，常規治療與中醫辨證深度融合可以使COPD患者的癥狀得到改善、急性加重次數下降、生命質量與運動耐力得到一定的提高。

目前，COPD的發病機制尚未完全明了。多數研究者認為氣道和肺部的慢性炎癥是導致COPD發生發展的主要機制，此外蛋白酶與抗蛋白酶系統、氧化與抗氧化作用以及自主神經系統等方面發生功能紊亂均在COPD進展中起重要作用[1]。最新研究發現，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎性小體是機體固有免疫的組分，它活化后參與了機體抵御外源性病原體的入侵[2-3]。目前研究已表明許多肺部的慢性炎癥性疾病中都存在NLRP3炎性小體的激活，這些研究結果為繼續探索COPD的發病機制及開發新藥物及新的診療手段提供了一定的思路。

方邦江教授通過長期的臨床實踐認為痰濁壅肺證是COPD的主要證型之一，治療上應以理肺、化痰、祛瘀立法，辨證論治，盡可能祛除外邪，改善癥狀，防止病情加重，使患者快速進入穩定期。故而創立了寬胸理肺湯，其由瓜蔞薤白半夏湯、二陳湯、三拗湯三方組成，臨場療效確切。而三子養親湯是醫治氣滯痰壅的經典名方，具有鎮咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本課題組前期臨床究結果表明，寬胸理肺湯合三子養親湯治療COPD患者，能有效抑制全身炎癥反應,降低白細胞計數和中性粒細胞比例，降低血清炎癥介質水平，改善肺功能，從而改善COPD急性加重期痰濁壅肺證患者的臨床癥狀體征[4-5]。為進一步證實寬胸理肺湯合三子養親湯的有效性及初步探討其藥理機制，本課題組擬采用煙熏誘導的大鼠COPD模型觀察寬胸理肺湯合三子養親湯對COPD大鼠肺組織的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性清潔級Wistar大鼠共42只，8周齡，體質量180～220 g，購自上海實驗動物中心,生產許可SCXK(滬)2018-0004。清潔級動物房飼養，恒溫(25±2)℃、恒濕，人工光照12 h，黑暗12 h，自由進食飲水。本研究經上海市中醫醫院動物實驗倫理及福利委員會討論、審查后同意進行動物實驗(動物倫理審查號：SZY-2018-010-21)。

1.1.2 藥物 實驗藥物及制備：處方組成：麻黃9 g、杏仁12 g、全瓜蔞30 g、薤白12 g、半夏10 g、橘紅6 g、茯苓15 g、甘草6 g、桃仁10 g、地龍9 g、蘇子10 g、萊菔子10 g、白芥子10 g。以上飲片由上海萬仕誠藥業有限公司提供。用自動煎藥機煎煮成200 mL湯藥，濃縮4倍，按實驗所需濃度稀釋。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑：NLRP3(Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-34410)、凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASP)抗體(Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-514414)、胱天蛋白酶1抗體(Abcam公司，美國，貨號：ab179515)、辣根酶標記山羊抗鼠、兔IgG(Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：7076/7074)、β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：3700)，白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-18酶聯免疫吸附試驗試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，貨號：F15810，F15950)，腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)、JC-1檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司，貨號：S0026，C2006)，MitoSOX Red探針(Thermo公司，美國，貨號：M36008)；脂多糖(Sigma公司，美國，貨號：L8274)。臺式高速冷凍離心機(Heal force公司，型號：Neofuge 15R)，熒光酶標儀(Thermo scientific公司，美國，型號：Var10skan Flash)，洗板機(Labsystems dragon公司，芬蘭，型號：Wellwash 4mk2)，電動勻漿機(上海凈信公司，型號：JX-FSTPRP-48)，微型垂直電泳、電轉移系統(Bio-rad公司，美國，型號：Mini-PROTEAN)，全自動顯影系統(Bio-rad公司，美國，型號：ChemiDocTMXRS+)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實驗動物按體質量進行隨機分組，共6組，每組7只，分組如下：寬胸理肺湯合三子養親湯低、中、高劑量組，模型組，陽性對照藥乙酰半胱氨酸組(NAC組)和對照組。COPD模型制作[6]：采用煙熏加氣管滴注脂多糖法制備COPD大鼠模型。對照組大鼠每天正常呼吸新鮮空氣，模型組大鼠在染毒箱內被動吸煙每天12支/次，染毒時間為30 min，其余時間呼吸新鮮空氣。并且在第1天及第14天時，將模型組大鼠進行麻醉后在氣管內滴注200 μL脂多糖水溶液(1 mg/mL)，滴注過程需緩慢，對照組使用相同體積的0.9%生理鹽水進行氣管滴注，滴注日不進行染毒操作。連續煙熏28 d后，驗證模型制備成功。

1.2.2 給藥方法 中藥高、中、低劑量組分別按照5、2.5、1.25 g生藥/kg的藥物劑量，為臨床用藥的2、1、0.5倍，乙酰半胱氨酸組的給藥劑量為0.8 g/kg，為臨床用藥的1倍，藥物均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制。

模型組和對照組分別灌服0.5%羧甲基纖維素鈉。每組藥物按照10 mL/kg的體積，1次/d，持續給藥28 d。

1.2.3 檢測指標與方法 各組大鼠在末次給藥后24 h，分別用10 mg/mL濃度的戊巴比妥納進行麻醉，隨后解剖開胸經心臟采集血液，并在常溫下，以3 500×g的速度進行離心操作，離心10 min后將血清抽取存放至EP管中，隨后保存在-20 ℃冰箱以備后續檢測，并且將一部分大鼠肺組織放置于4%多聚甲醛進行組織固定，以備制作病理切片，另取用錫紙將一部分肺組織包裹后放-80 ℃冰箱保存以備后續蛋白檢測，另一部分則快速進行線粒體抽取及相關檢測工作。蛋白質印跡法檢測按參考文獻[7]操作，將適量大鼠加入放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay，RIPA)裂解緩沖液，隨后組織勻漿、超聲裂解、低溫高速離心、抽取上清等操作步驟提取組織蛋白。并經過二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白定量后按調定的蛋白比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性待測。將蛋白樣本經凝膠電泳分離后電轉移至硝酸纖維素膜上。隨后經封閉、洗滌、一抗孵育(2%牛血清白蛋白稀釋至1∶500～1∶1 000)、洗滌、二抗孵育(5%脫脂奶粉稀釋至1∶1 000～1∶2 000)、洗滌、顯影等步驟，最后使用ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統進行蛋白半定量分析，用目的蛋白/內參蛋白的光密度值比率來表示目的蛋白的相對表達量。酶聯免疫吸附試驗檢測操作按試劑盒說明書進行。

線粒體膜電位、ATP、活性氧的測定[8]：1)按試劑盒步驟提取肺組織的線粒體；2)肺組織線粒體膜電位檢測：將提取的線粒體質量懸后按說明書要求的比例加入稀釋后的JC-1工作液。用熒光酶標儀進行檢測，檢測JC-1單體、JC-1聚合物分別按照490 nm/530 nm(綠光)及525 nm/590 nm(紅光)波長設置激發光和發射光；紅/綠的結果代表線粒體膜電位值；3)肺組織線粒體ATP的檢測：將提取的線粒體用ATP裂解液分解后離心提取上清液待檢，ATP檢測工作液與樣本按100/5 μL比例進行加樣，混合2 s以上上機檢測，ATP的濃度要參照標準曲線進行計算。最后用BCA法定量蛋白，將ATP濃度單位換算成μmol/mg。4)將分離的線粒體懸于40 μL的線粒體貯存液中。在黑色96孔板中毎孔加300 μL MitoSOX探針工作液及10 μL重懸的線粒體，隨后37 ℃避光孵育30 min，用含鈣鎂的漢斯緩沖鹽溶液洗滌3次后加入適量緩沖液，用熒光酶標儀檢測，將激發光與發射光分別設置510 nm及580 nm波長。用BCA法定量蛋白，將活性氧含量換算成熒光強度rfu/mg。

2 結果

2.1 肺組織線粒體損傷情況變化 與對照組比較，模型組大鼠肺組織線粒體ATP合成量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，線粒體膜電位水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，活性氧生成顯著增加。寬胸理肺湯合三子養親湯呈劑量依賴性升高COPD大鼠肺組織線粒體ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)，但對線粒體膜電位無顯著作用。陽性對照藥物NAC也可顯著升高COPD大鼠肺組織線粒體ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)。見表1。

表1 寬胸理肺湯合三子養親湯對COPD大鼠線粒體功能的影響

2.2 肺組織NLRP3炎性小體表達變化 COPD大鼠NLRP3、凋亡相關斑樣蛋白、胱天蛋白酶1-p10蛋白表達顯著上升，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。寬胸理肺湯合三子養親湯各劑量及NAC干預后，COPD大鼠的NLRP3炎性小體各蛋白表達呈顯著下降趨勢(P<0.05)。見圖1。

圖1 寬胸理肺湯合三子養親湯對COPD大鼠NLRP3炎性小體的影響

2.3 肺組織炎癥介質IL-1β、IL-18變化 酶聯免疫吸附試驗檢測發現COPD大鼠IL-1β、IL-18含量顯著高于對照組(P<0.05)。寬胸理肺湯合三子養親湯各劑量及NAC干預后，均可使COPD大鼠IL-1β、IL-18含量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 寬胸理肺湯合三子養親湯對COPD大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量的影響

3 討論

COPD屬于一種可防可治、常見的疾病，該病的主要表現是氣流受限與呼吸道癥狀，其導致原因是氣道和(或)肺泡異常，常由于長期暴露于有害顆粒或氣體所引發。本病以咳嗽、咳痰、呼吸困難為主要臨床表現，同時具有病情遷延不愈、癥狀常年存在或者疾病反復發作性，具有病程長、易復發等特征[9]。據世界衛生組織統計,全球約有6 500萬患者罹患中重度COPD；中國COPD總體發病率為8.6%，40歲以上人群發病率高達13.7%，以此估算我國COPD患者可達到9 990萬，已成為與高血壓、糖尿病“等量齊觀”的慢性疾病[10]。2017年世界范圍內有391.4萬人死于慢性呼吸道類疾病，而有319.7萬人死于COPD[11-12]。雖然目前治療COPD的手段可以在一定程度上使患者的臨床癥狀得到緩解，提高患者的生命質量，不過卻無法有效抑制病情的發展，所以，對COPD的發病機制進行深入探索，研究出更有效的治療措施具有一定的臨床意義。

COPD具有極為復雜的發病機制，目前尚未完全闡明。現代醫學對COPD的發病機制作了廣泛而深入的研究，提出了多種不同的假說，比如細胞凋亡、蛋白酶失衡、炎癥機制以及抗氧化失衡機制等，此外也有一些學者提出了無效受損修復、微生物組變化與自身免疫反應等機制[13]。上述假說的提出豐富了人類對COPD的認知，為相關研究的開展與深入提供了理論依據。COPD的特征是不完全可逆氣流受限，一般會伴有有害氣體或是顆粒的炎癥反應[14]，就本質來講，COPD屬于一種氣道的炎癥。NLRP3炎性小體是由NLRP3、凋亡相關斑樣蛋白和胱天蛋白酶-1所組成的一個多聚體蛋白復合物。活化的NLRP3炎性小體可使無活性的原胱天蛋白酶-1切割成具有活性的胱天蛋白酶-1片段，而后者可將原白細胞介素-1β和原白細胞介素-18裂解為成熟白細胞介素-1β和白細胞介素-18并分泌到細胞外發揮活性效應，啟動炎癥級聯反應。目前已有研究證實，線粒體活性氧是NLRP3炎性小體活化的關鍵上游效應因子[15-16]。而NLRP3炎性小體在COPD的發生、發展中起著重要作用。引起COPD的眾多病因(包括吸煙、感染、化學物質、職業粉塵、空氣污染等)都可引起肺組織的氧化應激增加，使NLRP3炎性小體過量激活，導致肺部慢性炎癥持續存在，引發肺氣腫和小氣道重塑及纖維化，從而導致氣體陷閉和氣流受限，繼而出現呼吸困難等癥狀。而動物實驗結果表明，抑制NLRP3炎性小體的上游激活物，或阻斷其下游效應分子能夠有效地減緩COPD的發生發展[17-20]。綜上所述，通過開發抑制NLRP3炎性小體及其下游效應分子的藥物，可能是緩解COPD進程，提高患者生命質量和生存率的一種新的藥物研究策略。

COPD在中醫學中并無專屬病名，根據其臨床表現、相關癥狀體征及病情進展狀態，大部分醫家將其辨病為“咳嗽”“喘證”“肺脹”等病。COPD臨床表現多是由肺部疾病日久遷延不愈所致，故“肺脹”病名與其契合度最高。目前大多醫家認為肺脹病因病機在于先有肺虛，之后邪實閉肺而喘,為本虛標實之病，也提示本病的形成和發展，不但與正虛相關,而且和外邪的反復侵襲有關，由于外邪入里而產生內外合邪，形成正虛邪戀,最終導致病情加重。此外在COPD發展的不同階段，病機特點有所側重，早期以肺虛為主，病情進一步發展,久病累及他臟，使患者脾與腎也受到影響，COPD不斷反復的關鍵內因為肺脾腎虛。COPD病位在肺，但其發生、發展與轉歸與肺、脾、腎三臟密切相關。普遍認為本虛標實是COPD的基本病機，本虛多涉及肺脾腎等臟腑，標實多與痰、瘀、六淫外邪等有關。寬胸理肺湯是方邦江教授以瓜蔞薤白半夏湯合二陳湯、三拗湯化裁而成，寬胸理肺湯可以有效地治療痰濁壅肺型COPD，寬胸理肺湯由瓜蔞薤白半夏湯、二陳湯、三拗湯三方化裁而成，瓜蔞薤白半夏湯可以通陽散結，行氣解郁，化痰寬胸，此處用其滌痰行水之功，對于痰濕水飲壅滯于肺臟，肺氣失于宣降所導致的咳嗽咳痰，氣促的癥狀有較好的療效，二陳湯燥濕化痰，三拗湯止咳平喘，三方合用，共同起到化痰平喘，行氣解瘀的功效。三子養親湯是醫治氣滯痰壅的經典名方，具有鎮咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本課題組前期臨床究結果表明，寬胸理肺湯合三子養親湯治療COPD患者，能有效抑制全身炎癥反應,降低白細胞計數和中性粒細胞比例，降低血清炎癥介質水平，改善肺功能，從而改善COPD急性加重期痰濁壅肺證患者的臨床癥狀體征，但其作用機制尚不明確。本研究發現寬胸理肺湯合三子養親湯能夠顯著改善COPD大鼠肺組織線粒體功能，具體體現在提高肺組織線粒體ATP合成量，減少線粒體損傷引起的活性氧釋放等，并且能夠抑制線粒體活性氧下游NLRP3炎性小體的活化。

綜上所述，寬胸理肺湯合三子養親湯可能通過抑制線粒體活性氧-NLRP3信號通路抑制COPD的發生發展。本研究不僅對COPD的西醫學機制作出創新性研究，并且為中藥驗方寬胸理肺湯合三子養親湯的臨床療效提供了現代分子生物學的基礎，為其臨床推廣提供了一定的實驗依據。