藏族藥小葉棘豆藥材質量標準研究△

夏夢棋，歐陽輝，吳宗耀，格桑頓珠，鐘國躍，格桑次仁，楊世林，頓珠*，馮育林*

1.江西中醫藥大學 中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006；

2.西藏藏醫藥大學，西藏 拉薩 850000

1 材料

1.1 試藥

13 批小葉棘豆藥材樣品收集自西藏自治區，經江西中醫藥大學鐘國躍教授鑒定為小葉棘豆Oxytropis microphylla（Pall.）DC.，樣品來源及批號見表1；對照品2′,4′-二羥基查耳酮（批號：wkq21011101，純度：97%，四川維克奇生物公司）；色譜純乙腈、甲酸（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

表1 13批小葉棘豆來源信息

1.2 儀器與耗材

LC-20 AT 型高效液相色譜儀、AUW 220 D 型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；COSMOSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Nacalai Tesque 公司）；KQ-5200 DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CLA 00001142 C 型超純水機（英國ELGA 公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；Reprostar 3 型薄層色譜攝像儀（瑞士卡瑪公司）。

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

本品多皺縮，碎斷，長可達15 cm。根圓錐狀，有分枝，表面黑褐色，質韌，斷面纖維狀。莖極短，叢生，基部殘存密被白色綿毛的托葉。輪生羽狀復葉，多破碎，完整者展開長5～15 cm；托葉卵狀披針形，近革質，與葉柄基部合生，背面被稠密的白色綿毛，具腺點；葉柄與葉軸密被白色綿毛，具腺點；小葉多數輪生，每輪2～4（6）枚，小葉片長橢圓形或卵形，長3～5 mm，寬約2 mm，邊緣內卷，上面疏被柔毛，兩面密生腺點。氣臭，味微苦、澀。小葉棘豆與來源于鐮莢棘豆藥材的性狀差異主要在于后者為奇數羽狀復葉，小葉呈鐮狀披針形，長7～12 mm[7]。

2.2 顯微鑒別

按照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）顯微鑒別法（通則2001）進行粉末制片，根據觀察對象不同，滴加相應試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄，見圖1。

圖1 小葉棘豆粉末顯微圖（×40）

灰白色粉末。非腺毛眾多，長100～600 μm，莖15～46 μm，無色，雙細胞，頂端銳尖，基部細胞短且壁較薄。導管多見，具螺紋和梯紋2 種，以梯紋導管為主，莖21～41 μm，紋孔呈窄縫。纖維少見，常碎斷，莖10～41 μm，頂端尖，壁厚有少數單紋孔。

2.3 薄層色譜法（TLC）鑒別

取小葉棘豆藥材粉末（過二號篩）1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取小葉棘豆對照藥材（批號：20200923）1 g，同法制成對照藥材溶液。按照《中國藥典》2020 年版通則0502，吸取上述2 種溶液各3 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

圖2 小葉棘豆藥材TLC圖

2.4 水分、浸出物、灰分測定

按照《中國藥典》2020 年版通則0832 水分測定法第一法烘干法測定樣品中水分，結果見表2。

以60%乙醇為溶劑，按照《中國藥典》2020 年版通則2201 醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定樣品中浸出物，結果見表2。

按照《中國藥典》2020 年版通則2302 灰分測定法對樣品中總灰分和酸不溶性灰分進行測定，結果見表2。

根據測定結果并結合《中國藥典》2020 年版中藥材的標準，水分、總灰分及酸不溶性灰分均以平均值的120%設限，浸出物以平均值的80%設限[20]，見表2。

表2 小葉棘豆藥材檢查項考察結果

2.5 高效液相色譜法（HPLC）含量測定

小葉棘豆含有黃酮類成分，研究表明，2′,4′-二羥查耳酮是其主要成分之一，具有抗炎鎮痛活性[22-23]，故選擇其作為含量測定的指標性成分。

2.5.1對照品溶液的制備 取2′,4′-二羥查耳酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.583 mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液2 mL，加甲醇制成0.046 6 mg·mL-1的溶液，即得。

2.5.2供試品溶液的制備 取小葉棘豆（批號：20201120）藥材粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（100 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5.3色譜條件 色譜柱為COSMOSIL C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），等度洗脫（0.01～48.00 min，40%B；48～55 min，95%B；55～65 min，40%B）；流速為1 mL·min-1；檢測波長為345 nm[22]；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.5.4方法學考察

2.5.4.1專屬性試驗 精密吸取空白溶液、2′,4′-二羥查耳酮對照品和供試品溶液注入色譜儀，并按2.5.3 項下色譜條件進行測試，理論板數不低于5000，色譜圖見圖3。小葉棘豆提取物中2′,4′-二羥查耳酮與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，說明該方法專屬性良好。

圖3 小葉棘豆樣品、2′,4′-二羥查耳酮對照品HPLC圖

2.5.4.2線性關系考察 將配制的2′,4′-二羥查耳酮對照品溶液按不同的倍數稀釋，得到7 個不同質量濃度（0.009 3、0.023 3、0.037 3、0.046 6、0.069 9、0.093 3、0.139 9 μg·mL-1）的溶液。精密吸取上述7 份對照品溶液注入液相色譜儀，并以色譜峰面積和2′,4′-二羥查耳酮對照品質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行線性關系考察，其線性關系為Y=5×107X-44 171（r=1.000）。結果表明，2′,4′-二羥查耳酮在0.009 3～0.139 9 μg·mL-1質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.4.3精密度試驗 精密吸取2′,4′-二羥查耳酮對照品溶液，按2.5.3 項下色譜條件連續進樣6 次，計算得到2′,4′-二羥查耳酮色譜峰面積的RSD 為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.4重復性試驗 取同一批（批號：20201120）樣品，按2.5.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，并按2.5.3 項下色譜條件進行測試。小葉棘豆提取物中2′,4′-二羥查耳酮平均質量分數為1.17%，RSD為1.88%，說明該方法重復性較好。

2.5.4.5穩定性試驗 取小葉棘豆（批號：20201120）供試品溶液，按2.5.3 項下色譜條件分別在0、2、4、6、10、17、24 h 進樣測定，計算得到2′,4′-二羥查耳酮色譜峰面積的RSD 為0.47%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.4.6加樣回收率試驗 取小葉棘豆（批號：20201120）供試品溶液6 份，分別精密加入相同體積的對照品（0.105 2 mg·mL-1），按2.5.2 項下方法制備供試品溶液，按2.5.3 項下色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率，2′,4′-二羥查耳酮平均回收率為100.49%，RSD為2.99%，具體結果見表3。

表3 小葉棘豆中2′,4′-二羥查耳酮加樣回收率試驗結果

2.6 樣品含量測定

取13 批小葉棘豆樣品，按2.5.2 項下方法制備樣品溶液，按2.5.3 項下色譜條件進行測定，計算樣品中2′,4′-二羥查耳酮成分的含量，結果見表4。結果表明，13 批小葉棘豆樣品的2′,4′-二羥查耳酮質量分數為0.75%～1.72%，均值為1.34%，取均值的80%設限，其質量分數不得少于1.0%，13 批藥材中有11 批合格，合格率為84.6%，故規定2′,4′-二羥查耳酮質量分數不得低于1.0%。

表4 13批小葉棘豆中2′,4′-二羥查耳酮質量分數 %

3 結果與討論

本研究考察了13 批小葉棘豆浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，根據測定結果并結合《中國藥典》2020 年版中藥材的標準，建議規定小葉棘豆的醇溶性浸出物不得少于16%、水分不得超過7%、總灰分不得超過32%、酸不溶性灰分不得超過26%，以干燥品計算，2′,4′-二羥基查耳酮質量分數不得少于1.0%。

“莪大夏”為藏醫臨床常用特色藥材，本課題組調查表明小葉棘豆O.microphylla為其主流商品之一（共收集“莪大夏”藥材18 批，經基原鑒定，其中13 批為該種），而有關標準中并未收載該種。同時該種的資源較為豐富，具有利用的價值。本研究建立的方法準確度好、靈敏度較高，可為后續小葉棘豆藥材質量標準的建立及質量控制提供參考。