寬體金線蛭仿生酶解液物質基礎分析△

董萍萍，王常瞵，劉國飛，王紅，李華健，張加余，王少平*，代龍*

1.濱州醫學院 藥學院，山東 煙臺 264003；

2.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250300

寬體金線蛭是當前藥材市場流通和臨床應用的主流品種，味咸、苦，性平，歸肝經，為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigraWhitman 的干燥全體，具有破血逐瘀的功效[1]。寬體金線蛭臨床多用于治療腦血管疾病[2-3]、冠心病、心絞痛[4]、中風偏癱[5-6]等。動物藥具有成分復雜、藥效物質基礎不明確等特點。目前，大多數動物類中藥的鑒別主要依靠性狀、顯微及理化鑒別方法，含量測定項也大多以直接測定蛋白質、多糖含量進行質量控制，質量控制方法缺乏全面性、針對性和專屬性，這也是構建和完善動物藥材質量評價體系的難點和重點之一。

寬體金線蛭具有較強的抗凝活性，本課題組前期實驗建立了其體外仿生酶解工藝，對寬體金線蛭仿生酶解液的體外抗凝活性進行研究，發現其能產生較強的抗凝活性[7]。然而，在經過體內口服給藥或體外仿生酶解后，多肽及大分子類物質被消化，目前寬體金線蛭物質基礎仍不明確，因此利用化學分析及光譜分析等手段，對其進行固形物、無機鹽、肽、氨基酸含量測定，核苷特征圖譜及肽特征圖譜研究，從化學定性和定量的角度對寬體金線蛭仿生酶解液進行物質基礎研究。同時，從生物活性肽的角度對寬體金線蛭仿生酶解液進行質量控制研究，能夠保證其質量可控性和一致性。

1 材料

1.1 儀器

PHS-25型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；AL-204型萬分之一電子天平、XS105型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）；DDS-11A型電導率儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；L-8900型全自動氨基酸分析儀（日本日立公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（CLASS-VP工作站）、UV-1800型紫外-可見分光光度計均購于日本島津株式會社。

1.2 試藥

采集包含道地產區（山東省濟寧市）、主產區（江蘇省如皋市、浙江省平湖市）3個產地的15批寬體金線蛭藥材（S1～S15），經濟南市藥品檢驗所主任藥師宋希貴鑒定為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigraWhitman 的全體，經檢驗均符合《中華人民共和國藥典》2020年版水蛭項下的各項規定。

對照品木犀草苷（批號：111720-201810）、次黃嘌呤（批號：140661-201704）、尿嘧啶（批號：100469-201302）、尿苷（批號：110887-201803）、黃嘌呤（批號：140662-200802）均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98%；胰蛋白酶（批號：20190616，國藥集團化學試劑有限公司）；胃蛋白酶（批號：RH156275，上海易恩化學技術有限公司）；牛血清白蛋白（批號：E1905152）、三氟乙酸（TFA，批號：L1803213）均購自阿拉丁試劑有限公司；福林酚（批號：S07D9J77046，上海源葉生物科技有限公司）；100 Da 即用型透析袋（批號：131057-2008，北京瑞達恒輝科技發展有限公司）；硫酸銅、酒石酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉等試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

2 方法

2.1 含量測定

2.1.1供試品溶液的制備 精密稱取寬體金線蛭粉末2.0 g（過五號篩），加入去離子水20 mL，稱定質量，煮沸10 min，補足減失質量，冷卻至40 ℃后用稀鹽酸調節pH 為2，加入酶底比1%的胃蛋白酶，40 ℃酶解1 h 后用氫氧化鈉溶液調節pH 至8，加入酶底比1%的胰蛋白酶于40 ℃下繼續酶解3 h，煮沸10 min殺酶，然后將酶解液調至中性，5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm）后取上清液，殘渣加水洗滌2～3 次后同樣條件離心，合并上清液，定容至20 mL，得到生藥質量濃度為0.1 g·mL-1的仿生酶解液。

2.1.2固形物含量測定 精密量取15 批仿生酶解液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量。

2.1.3無機鹽含量測定 精密稱取無水氯化鈉0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 g，分別加入去離子水100 mL 充分溶解，采用電導儀測定7 份不同質量濃度標準溶液的電導率（σ）。以σ（mS·cm-1）為縱坐標（Y），鹽質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標（X）繪制標準曲線，用電導儀測定15 批仿生酶解液的σ值，代入標準曲線計算含鹽量。

2.1.4肽含量測定

2.1.4.1對照品溶液的制備 精密稱取牛血清白蛋白15 mg，加去離子水溶解，定容至50 mL，即得。

2.1.4.2堿性銅試液的制備 精密稱取氫氧化鈉10 g、碳酸鈉50 g，加去離子水400 mL 溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5 g，加去離子水50 mL，另取硫酸銅0.25 g，加去離子水30 mL，將兩液混合作為乙液。使用時合并甲液和乙液，加去離子水定容至500 mL即得。

2.1.4.3福林酚試液的制備 取1 mol·L-1福林酚試劑1 mL，加去離子水至8 mL，即得。

2.1.4.4標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于0～5 號具塞試管中，各加去離子水至1.0 mL，再分別加入堿性銅試液1.0 mL 和福林酚試液4.0 mL，立即混勻，置55 ℃水浴中反應5 min 后取出，置冷水浴中冷卻10 min。以0 號管為空白，在650 nm 處迅速測定吸光度（A）。以A為縱坐標（Y），牛血清白蛋白含量為橫坐標（X）繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。

2.1.4.5供試品測定 精密量取15 批仿生酶解液各1.0 mL，按2.1.4.4 項下自“加入堿性銅試液1.0 mL”起，依法測定A，代入回歸方程計算肽含量。

2.1.5氨基酸含量測定 仿生酶解提取液利用100 Da透析袋進行樣品脫鹽處理后，利用氨基酸分析儀分析[8]，得到酶解液中游離氨基酸的含量；仿生酶解提取液進行樣品脫鹽處理后，加入6 mol·L-1鹽酸溶劑，在減壓條件下將水解管密封后放入烘箱，在110 ℃水解24 h，冷卻，過濾水解液后旋蒸去除鹽酸，利用氨基酸分析儀分析，得總氨基酸含量。

2.2 核苷特征圖譜

2.2.1色譜條件 COSMOSIL 5C18-PAQ 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（1∶99），等度洗脫35 min；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm[9-10]。

2.2.2對照品溶液的制備 分別取對照品次黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷、黃嘌呤適量，精密稱定，分別加去離子水制成質量濃度分別為12.0、1.5、4.5、100.0μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3方法學考察

2.2.3.1精密度考察 取供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件連續進樣6次，統計4個峰的保留時間和峰面積，選擇峰形較好、峰面積較大的2 號峰（次黃嘌呤）為S 峰[11]，計算15批藥材各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.2.3.2穩定性考察 取供試品溶液，在供試品溶液制備完成的第0、4、8、12、18、24 小時分別進樣測定，統計4個峰的保留時間和峰面積，以2號峰（次黃嘌呤）為S 峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.2.3.3重復性考察 取平行制備的6 份供試品溶液，分別進樣測定，統計4 個峰的保留時間和峰面積，以2號峰（次黃嘌呤）為S峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.2.4建立寬體金線蛭仿生酶解液核苷特征圖譜 精密吸取供試品溶液5μL，分別進樣測定，記錄35 min的色譜圖。根據15 批寬體金線蛭酶解液測定結果所顯示的峰個數、相對保留時間和相對峰面積等相關參數，以2 號峰（次黃嘌呤）為S 峰，計算15 批酶解液各峰的相對保留時間，建立寬體金線蛭仿生酶解液核苷特征圖譜。

2.3 肽特征圖譜

2.3.1色譜條件 YMC-Pack PROTEIN-RP 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.5%TFA 水溶液（A）和0.5%TFA 乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，99%A；10～60 min，99%～75%A；60～65 min，75%～99%A；65～70min，99%A）；流速為1.0mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm。

2.3.2對照品溶液的制備 取對照品木犀草苷適量，精密稱定，加去離子水制成質量濃度為0.2mg·mL-1的木犀草苷溶液，精密量取木犀草苷溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3.3方法學考察

2.3.3.1精密度考察 取供試品溶液，按照2.3.1項下色譜條件連續進樣6次，統計6個峰的保留時間和峰面積，選擇峰形較好、峰面積較大的5 號峰（木犀草苷）為S 峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.3.2穩定性考察 取供試品溶液，在供試品溶液制備完成的第0、4、8、12、18、24 小時分別進樣測定，統計6個峰的保留時間和峰面積，以5號峰（木犀草苷）為S 峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.3.3重復性考察 取平行制備的6 份供試品溶液，分別進樣測定，統計6 個峰的保留時間和峰面積，以5號峰（木犀草苷）為S峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2.3.4建立寬體金線蛭仿生酶解液肽特征圖譜 取15批酶解液樣品，精密吸取10μL分別進樣測定，記錄70 min 的色譜圖。根據測定結果中峰個數、相對保留時間和相對峰面積等相關參數，以峰形較好、峰面積較大的5 號峰（木犀草苷）為S 峰，計算15批藥材各峰的相對保留時間，建立寬體金線蛭仿生酶解液肽特征圖譜。

3 結果

3.1 含量測定結果

3.1.1固形物含量測定結果 由表1可知，寬體金線蛭仿生酶解液的固形物質量濃度為76.3～78.5mg·mL-1，平均值為77.6 mg·mL-1，以（± 3s）為固形物含量波動限度，故擬定寬體金線蛭仿生酶解液固形物質量濃度的測定范圍為75.5～79.7 mg·mL-1。

表1 15批寬體金線蛭仿生酶解液質量濃度

3.1.2無機鹽含量測定結果 電導率和鹽質量濃度之間存在線性關系，線性方程為Y=1.177 2X+0.227 3（r=0.999 5），線性結果良好。

由表1可知，寬體金線蛭仿生酶解液的無機鹽質量濃度為11.2～12.3 mg·mL-1，平均值為11.7 mg·mL-1，以（± 3s）為含量波動限度，則寬體金線蛭仿生酶解液無機鹽質量濃度測定范圍為10.7～12.7 mg·mL-1。

3.1.3肽含量測定結果 牛血清白蛋白含量與A之間存在線性關系，線性回歸方程為Y=2.694 3X+0.010 5（r=0.999 6），線性結果良好。

由表1結果可知，寬體金線蛭仿生酶解液的肽質量濃度為44.3～47.3 mg·mL-1，平均值為46.0 mg·mL-1，以（± 3s）為含量波動限度，則擬定寬體金線蛭仿生酶解液肽質量濃度測定范圍為42.6～49.4 mg·mL-1。

3.1.4氨基酸含量測定 由表1結果可知，寬體金線蛭仿生酶解液的游離氨基酸質量濃度為2.2～2.8mg·mL-1，平均值為2.5 mg·mL-1，以（± 3s）為含量波動限度，則寬體金線蛭仿生酶解液游離氨基酸質量濃度測定范圍為1.9～3.1 mg·mL-1。總氨基酸質量濃度為49.8～51.0 mg·mL-1，平均值為50.5 mg·mL-1，以（± 3s）為含量波動限度，則寬體金線蛭仿生酶解液總氨基酸質量濃度測定范圍為49.4～51.6 mg·mL-1。

3.2 核苷特征圖譜

3.2.1特征峰的指認 根據仿生酶解液樣品S1與各核苷對照品的特征圖譜指認各特征峰，結果見圖1。

3.2.2方法學考察結果 精密度考察結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明儀器精密度良好；穩定性結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明供試品溶液在制備完成后的24 h內穩定性良好；重復性結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明本特征圖譜測定方法的重復性良好。

3.2.3建立寬體金線蛭仿生酶解液核苷特征圖譜 15批酶解液（S1～S15）的核苷特征圖譜見圖2，特征峰相對保留時間見表2。各峰相對保留時間的RSD均小于1%，說明寬體金線蛭酶解液批間關鍵成分一致，供試品色譜中呈現出4個特征峰，4個峰應分別與相應對照品參照物峰的保留時間相對應，其中，與次黃嘌呤參照物峰相對應的峰為S 峰，計算其余各特征峰與S峰的相對保留時間[規定值為0.68（峰1）、1.00（峰S）、1.05（峰3）、1.26（峰4）]，其相對保留時間應在平均值±10%范圍之內。

圖2 15批寬體金線蛭仿生酶解液核苷特征圖譜

表2 15批寬體金線蛭仿生酶解液核苷特征圖譜特征峰相對保留時間

3.3 肽特征圖譜

3.3.1特征峰的指認 由圖3 可知，仿生酶解液樣品中共有6個特征峰，其中峰5為內參物木犀草苷。

圖3 仿生酶解液樣品（S1）與木犀草苷對照品特征圖譜

3.3.2方法學考察結果 精密度考察結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明儀器精密度良好；穩定性結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明供試品溶液在制備完成后的24 h內穩定性良好；重復性結果顯示，各峰的相對保留時間的RSD 均小于1%，相對峰面積的RSD 均小于5%，表明本特征圖譜測定方法的重復性良好。

3.3.3建立寬體金線蛭仿生酶解液肽特征圖譜 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件”（2012版）進行評價，將15 批（S1～S15）寬體金線蛭仿生酶解液肽譜導入系統，生成肽特征圖譜（圖4）和肽對照特征圖譜（圖5），標定6 個共有色譜峰，通過與對照品色譜圖比較，確認5號峰為木犀草苷。

圖4 15批寬體金線蛭仿生酶解液肽特征圖譜

圖5 15批寬體金線蛭仿生酶解液肽對照特征圖譜

由表3 可知，供試品色譜中應呈現6 個特征峰，與木犀草苷參照物峰相對應的峰為S 峰，計算其余各特征峰與S 峰的相對保留時間，其相對保留時間應在平均值±10%范圍之內。

表3 15批寬體金線蛭仿生酶解液肽特征圖譜特征峰相對保留時間

4 討論

通過測定15 批寬體金線蛭仿生酶解液的固形物、無機鹽、肽、氨基酸質量濃度，并擬定酶解液中各物質質量濃度測定范圍，從化學定量的角度對寬體金線蛭進行質量控制。

由固形物含量測定可知，寬體金線蛭經過仿生酶解后得膏率平均值為77.6%，與本課題組前期實驗[12]采用的水煎煮等其他提取方式相比，藥材利用率明顯提高。無機鹽含量測定結果顯示，其在酶解液中質量濃度平均值為11.7 mg·mL-1。無機鹽來源主要為寬體金線蛭藥材自身所含有的鹽分及酶解時調節pH所帶入的鹽分。酶解液中肽平均質量濃度為46.0 mg·mL-1，固形物平均質量濃度為77.6 mg·mL-1，肽含量占固形物含量的比例為59.28%。氨基酸含量測定結果表明，寬體金線蛭仿生酶解液中游離氨基酸含量占固形物3.22%，總氨基酸含量占固形物65.08%，因此固形物中61.86%為肽（總氨基酸量-游離氨基酸量），與肽含量測定的結果基本吻合。

核苷類成分是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，參與DNA 代謝過程，次黃嘌呤是水蛭藥材中的主要核苷類成分，是發揮平喘作用的主要有效成分之一，具有擴張支氣管、對抗組胺及毛果蕓香堿引起的支氣管收縮的作用[13-14]，其性質穩定、含量較高、較容易獲得且出峰時間適中，因此選擇次黃嘌呤作為內標物。由于流動相系統中水相所占的比例較大，為保護色譜柱，采用親水柱COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱，而非普通C18色譜柱。

由于寬體金線蛭仿生酶解液中尚未明確特定的成分，因此無法準確指認出S 峰，只能通過外加內標物作為S 峰來計算相對保留時間，從而建立特征圖譜。本課題組實驗前期首先以與仿生酶解液中成分相類似的肽類、氨基酸等為內標物，但經過實驗發現，奧曲肽、L-甘-甘-甘三肽、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、異亮氨酸等在254 nm 均無色譜峰出現，選擇帶有苯環的氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸進行實驗，三者在254 nm 雖有吸收峰，但是保留時間太短，不適合作為S 峰。經實驗發現，木犀草苷在該色譜條件下具有較強的吸收峰，且出峰時間適中，分離度良好，適合作為內標物加入到酶解液中。本研究建立的方法主要針對酶解液的主成分——肽類物質，具有穩定性好、重復性好、精密度高、特征性強的特點，能夠較好地對寬體金線蛭仿生酶解液肽類物質進行質量控制，可以作為寬體金線蛭定性鑒別的重要手段之一，為寬體金線蛭的品質鑒定提供參考。