基于網絡藥理學的經典名方枸杞湯治療糖尿病作用機制分析△

周洪立，鄭慧麗，朱悅，尚爾鑫，宿樹蘭，段然，段金廒，許惠琴*

1.南京中醫藥大學 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；

2.寧夏枸杞創新中心，寧夏 銀川 750000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種慢性進行性疾病，發病率高且增長迅速，到2030 年全球DM 患病率預計將超過10.2%[1]。DM 的主要病理特點是胰島素分泌缺陷或其他生物學作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝紊亂[2]。患者血糖長期處于高水平狀態，大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經、眼睛、足等，引發多種并發癥及隨之而來的生活質量下降和死亡風險增加[3]。一系列橫斷面和前瞻性分析也表明，血糖濃度升高與并發癥的發生呈正相關[4-7]。我國DM 患病人數位居世界首位，僅2015 年我國就有130 萬人死于DM 及其并發癥，給社會帶來嚴重的健康與經濟負擔[7]。現階段，DM 的主要治療措施包括口服降糖藥、注射胰島素、飲食管理、鍛煉等，這些措施在控制血糖方面表現出良好的效果，但無法從根本上治愈DM 及延緩其并發癥的發生和發展。

中醫將DM 歸屬于“消渴”范疇，傳統觀點認為，其主要病機以陰液虧虛為本、燥熱偏勝為標、瘀血為患貫穿始終，針對該病機特點，以滋補肝腎、清熱生津、化瘀通絡為基本治法[2]。南朝齊陳延之[8]《小品方》中形成了消渴三消分治的雛形，并收載“枸杞湯”治療“內消”，該方由枸杞枝葉、栝樓根、石膏、黃連、生甘草組成。《小品方》原書記載“消渴者，原其發動，此則腎虛所致”“夫內消之為病，皆熱中所作也，小便多于所飲，令人虛極短氣……治之枸杞湯”，是中醫治療消渴病的較早記載。該方以枸杞枝葉為君藥，符合《神農本草經》枸杞“主熱中消渴”[9]與《藥性論》枸杞“子、葉同說，味甘，平。補益精，諸不足，易顏色，變白，明目，安神，令人長壽”[10]的功效認識，補益肝腎兼能清熱；栝樓根（即天花粉）、石膏與黃連等藥材清熱生津，生甘草補氣兼能清熱，符合中醫對消渴癥“肝腎虧虛，陰虛內熱”病機的認識。該方曾被唐代孫思邈收錄于《備急千金要方》[11]，足見其對該方組方與療效的認可。

基于血糖控制是臨床改善DM 進程的根本方法及對枸杞葉“主治虛勞煩渴”傳統功效的認識，本研究利用網絡藥理學的整體性與系統性，對枸杞湯改善DM 的作用機制進行初步探討，分析其可行性，為臨床DM治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 枸杞湯有效成分的篩選與整理

通過中國知網（CNKI）、PubMed數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/），以“枸杞葉”“枸杞芽”“枸杞葉化合物”為關鍵詞檢索枸杞葉有效成分信息，利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）[12]將所得化合物以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選，獲得枸杞葉有效成分；通過TCMSP 分別收集黃連、石膏、天花粉、甘草4 味中藥的有效成分，同上述枸杞葉篩選條件獲得有效化學成分，記錄成分的編號和名稱。通過TCMSP、PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ChemDraw 18.0 軟件獲得有效成分的分子結構。

1.2 枸杞湯有效成分及DM疾病靶點的預測與收集

將篩選所得枸杞湯有效成分通過TCMSP、SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstarget prediction.ch/）[13]預測對應靶點。以“diabetes mellitus”為疾病關鍵詞，通過OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.drugbank.ca/）數據庫檢索，并與枸杞湯靶點取交集，獲得枸杞湯改善DM 的潛在靶點信息。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將藥物有效成分與疾病靶點取交集，并上傳至STRING 11.5 數據庫（https://string-db.org）構建交集靶點PPI 網絡，生物種類設定為人類，將最小相互作用閾值設為0.9。利用Cytoscape 3.7.2 軟件中的MCODE 和Network Analyzer插件進行聚類和拓撲分析，獲得枸杞湯調節DM的核心靶點。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析

將篩選得到的枸杞湯調節DM 的靶點導入Metascape 3.5 平臺，將生物種類設定為人類，設置P＜0.001，分別進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，并將所得數據進行可視化分析。

1.5 藥物-成分-靶點網絡構建

將所得枸杞湯有效成分、治療DM 相關靶點及通路富集分析結果進行映射，并導入Cytoscape3.7.2軟件以構建藥物-成分-靶點網絡。

1.6 分子對接驗證

PDB 數據庫下載對接蛋白的PDB 結構，PubChem 數據庫下載配體的SDF 結構，利用Open Babel 軟件將SDF 配體小分子轉換為PDB 格式。然后通過PubChem 數據庫和Open Babel 3.1 軟件得到化合物PDB 格式文件，利用AutoDock Vina 1.5.6軟件進行分子對接，獲取其結合自由能信息。

2 結果

2.1 枸杞湯有效成分的收集

通過TCMSP篩選和查閱文獻[14-24]得到活性化合物數目分別為枸杞葉6 個、天花粉2 個、黃連6個、甘草80 個，石膏的主要成分CaSO4未檢索到相關靶點，故不計入統計。去除重復后，枸杞湯共有活性成分94個，見表1。

表1 枸杞湯活性成分拓撲信息

續表1

續表1

2.2 潛在治療靶點預測

通過TCMSP、SwissTargetPrediction 平臺預測靶點，共獲得枸杞湯靶點247 個。從GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 數據庫檢索疾病靶點，整合并刪除重復值，經UniPort 數據庫規范化后得到1832 個疾病靶點。利用Venn 作圖取交集，如圖1 所示，得到211個枸杞湯改善DM的潛在靶點。

圖1 枸杞湯治療DM的藥物-疾病交集靶點

2.3 PPI網絡分析

將從STRING 11.5 數據庫獲得的靶點PPI 圖導入Cytoscape 3.7.2 軟件，通過MCODE 聚類分析功能得到核心子網絡，如圖2～3 所示，靶點度值越大，形狀越大，表明靶點與網絡中其他靶點連接越緊密。熱休克蛋白90α家族成員A（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MAPK3、表皮生長因子受體（EGFR）等排名靠前的靶點為枸杞湯改善DM的核心靶點。

圖2 枸杞湯治療DM核心靶點PPI

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

圖3 枸杞湯治療DM核心靶點PPI子網絡

2.4.1GO 分析 利用Matescape 3.5 平臺對枸杞湯改善DM的潛在靶點進行GO分析，枸杞湯主要通過參與循環系統過程、對細胞外刺激的反應、蛋白質磷酸化、分泌調節、細胞化學穩態、調節體液水平、小分子代謝過程的調節、腺體發育、離子傳輸的調節、對細胞因子的反應、調節細胞對壓力的反應、老化等1996 個生物過程發揮改善DM 的作用；細胞組分條目共131 個，主要涉及膜筏、受體復合物、細胞質核周區、神經元細胞體、膜側、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）復合物、黏著斑、轉移酶復合物、轉移含磷基團、細胞器外膜等；主要涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、氧化還原酶活性、激酶結合、脂質結合、磷酸酶結合、激素結合、胰島素受體底物結合、絲氨酸水解酶活性、氧化還原酶活性等228 個分子功能。將P＜0.001 排名前10 的條目進行數據可視化處理，見圖4。

圖4 枸杞湯治療DM核心靶點GO分析

2.4.2KEGG 分析 利用Matescape 3.5平臺對枸杞湯調節DM 的潛在靶點進行KEGG 分析，枸杞湯主要通過參與調節PI3K/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、環磷酸腺苷（cAMP）、RAS 相關蛋白1（RAP1）信號通路、糖尿病并發癥（diabetic complications）中的晚期糖基化終末產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、內分泌抵抗（endocrine resistance）、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、叉形頭轉錄因子O（FoxO）信號通路、胰島素（insulin）信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、2 型糖尿病（T2DM）等203 個通路發揮改善DM 的作用，將P＜0.001 排名前20 的條目運用R語言繪制氣泡圖，見圖5。

圖5 枸杞湯治療DM核心靶點KEGG通路分析

2.5 藥物-成分-靶點網絡

通過CytoScape 3.7.2 軟件構建藥物-成分-靶點網絡，如圖6 所示，該網絡共有155 個節點（包括4種藥材、94 個活性成分、57 個靶點）。拓撲分析結果如表2所示，鱗葉甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等節點度值排名靠前，可能為枸杞湯中的主要活性成分。

圖6 枸杞湯治療DM藥物-成分-靶點網絡分析

2.6 分子對接結果

分析枸杞湯的藥物-成分-靶點網絡可知，鱗葉甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等成分的節點度值排名靠前，可能為枸杞湯的主要活性成分。選擇核心化合物中的鱗葉甘草素A 與甘草查耳酮B對應核心靶點中的細胞色素P450家族19亞家族A 肽1（CYP19A1）、雌激素受體2（ESR2）、蛋白酪氨酸性磷酸酶非受體型1（PTPN1）、EGFR 進行分子對接，結合自由能結果見表2，可視化對接結果見圖7。結果顯示，枸杞湯中鱗葉甘草素A與甘草查耳酮B 均能與對應靶點自發結合，且鱗葉甘草素A 與CYP19A1、ESR2、PTPN1 之間的結合自由能較低，甘草查耳酮B 與EGFR 之間的結合自由能較低，表明鱗葉甘草素A 和甘草查耳酮B 與對應靶點之間有較好的結合活性，側面驗證了網絡藥理學的預測結果。

圖7 枸杞湯治療DM核心成分和靶點分子對接模式圖

表2 枸杞湯核心成分與靶點蛋白分子對接結果

3 討論

DM 的西醫治療以控制血糖及生活管理為主。血糖的控制包括口服降糖藥及注射胰島素，在降糖方面效果顯著，但長期高血糖所伴隨的并發癥給疾病的治療帶來了諸多的挑戰，如DM 臨床一線治療藥物二甲雙胍因其使用禁忌中明確包含了糖尿病腎病（DKD），給DKD 患者降糖藥物的選擇帶來了困擾。在糖尿病視網膜病變（DR）等并發癥的治療中，在控制血糖的基礎上多以對癥治療為主，以降低疾病進一步發展所帶來的風險，對已發生的病理改變多采用對癥治療，如部分糖尿病性黃斑水腫（DME）患者經抗VEGF 療法治療后微血管瘤、滲出、靜脈串珠、新生血管、出血等病變有所改善，但這并未解決其本質問題，即視網膜毛細血管周細胞凋亡、內皮細胞增殖和繼發的毛細血管閉塞，以及缺血缺氧導致的VEGF 釋放與進一步的眼底損傷。DM 的疾病機制探究和臨床治療方法開發是亟須解決的醫學問題[25-26]。生活管理亦是DM 患者疾病控制的重要手段，當前對DM 患者的管理包括營養治療原則，并參與規律、適量的體育鍛煉。DM 患者的自我管理早在隋唐時期就有記載，巢元方提出“消渴”患者“先行一百二十步，多者千步，然后食之”，孫思邈提出“消渴”三慎:“一飲酒，二房事，三咸食及面”[27-28]。

近年來，隨著中醫藥治療DM 研究的不斷深入，發現復方及單味中藥在改善DM 及其并發癥中療效顯著，而用藥局限性及不良反應相對較小。中藥具有多成分多靶點的優勢，可干預疾病的不同靶點與信號通路，表現出多種藥理學活性。枸杞湯作為中醫經典方劑，為“治渴而利者方”，方中枸杞葉清熱止渴、祛風明目、生津補肝，主治虛勞發熱、煩渴、目赤昏痛、障翳夜盲等證，為君藥；天花粉清熱瀉火、生津止渴，黃連泄火解毒，石膏清熱瀉火、除煩止渴共為臣藥；甘草為使，調和諸藥。諸藥合用共奏滋陰清熱、生津補虛之效。本課題組前期研究發現，枸杞葉中富含多糖、酚酸、黃酮等活性成分，包括蘆丁、咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、槲皮素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷等，且枸杞葉提取物可調節血糖和血脂水平，降低蛋白尿、轉氨酶水平和減輕胰島素抵抗，對糖尿病大鼠腎小球、腎小管和胰島細胞起到保護作用[29-31]。亦有研究表明，枸杞葉提取物通過抑制高血糖介導的腎臟氧化應激和炎癥改善糖尿病腎病，治療后，糖尿病大鼠血清肌酐、尿素氮顯著降低，白蛋白水平升高，而尿蛋白水平明顯降低，肌酐清除率明顯升高[32]。《名醫別錄》記載：“黃連止消渴。”其藥效物質基礎為黃連素，在DM及其并發癥的治療中應用已久[33-34]。黃連素能夠增加葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）的表達及活性，從而增加細胞對葡萄糖的攝取，起到降糖效應[35]，并可抑制高糖培養的腎小球系膜細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）和纖維連接蛋白（FN）的表達，發揮抗DKD的重要作用[36]。研究發現，枸杞湯中的關鍵化合物光甘草定具有降糖作用，能顯著提高小鼠體質量，糖耐量，肝、腎、胰組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低肝、腎、胰腺組織中纖維蛋白原（FBG）水平和丙二醛（MDA）含量[37]。而甘草查耳酮具有抗氧化活性，能增強細胞本身抗氧化能力[38]。

由成分-靶點-通路網絡可知，枸杞湯中94 個活性成分主要通過HSP90AA1、SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3、EGFR、磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基1（PIK3R1）、PIK3CA、Akt1 等靶點，影響PI3K-Akt、cAMP、FoxO、AGE-RAGE、RAP1、HIF-1、VEGF、內分泌抵抗、胰島素抵抗等信號通路，可能通過改善胰島素抵抗、糖異生、葡萄糖轉運、炎癥及免疫反應來發揮改善DM 的作用。FoxO1 參與了β細胞的增殖、分化與凋亡、胰島素抵抗及肝臟葡萄糖生成，且在脂質代謝和脂肪組織調節方面具有重要作用，未來可能成為糖脂代謝性疾病的治療靶點[39]。VEGFA 是視網膜新生血管形成過程中的關鍵物質，DM 患者視網膜的長期缺血缺氧狀態會引發VEGF 表達上調，并激活下游PI3K/Akt 信號通路，加速視網膜血管內皮細胞形成新生微血管腔這一過程[40]。HIF-1α是細胞內重要的缺氧信號蛋白，參與血管形成、糖代謝、紅細胞生成及細胞的存活和凋亡等過程，而VEGF 主要受HIF-1α的轉錄調控，在高血糖和缺血缺氧狀態下會誘導HIF-1α的表達上調，作為其下游重要的靶基因，VEGF 也隨之上調[41-42]。AGEs 在糖尿病及其并發癥中占有重要位置，陳玉萍等[43]認為，AGEs是糖尿病“腎陰虧虛、內熱傷陰津”的重要物質基礎。

“陰虛為本，燥熱為標”為消渴病的基本病機，貫穿“消渴”的疾病始終。近年來，通過生物信息學、蛋白質組學、代謝組學、基因芯片等技術發現陰虛火旺證候主要涉及cAMP、花生四烯酸（arachidonic acid）、鞘脂（sphingolipid）等差異代謝產物，JAK/STAT、胰島素、MAPK、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）等信號通路[44-47]。cAMP 作為信號分子參與活性氧（ROS）產生與應激反應，可促進下游cAMP 依賴性蛋白激酶（PKA）和環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）蛋白磷酸化，清除ROS，降低氧化應激水平，減輕2型糖尿病誘導的神經毒性[48]。而枸杞湯對上述部分信號通路及代謝產物具有干預作用，可能是其改善“陰虛火旺”證候的作用靶點。

本研究采用網絡藥理學方法構建了藥物-成分-靶點-疾病網絡，為枸杞湯治療DM 作用機制的深入研究提供了參考，同時也為DM 的中醫臨床治療提供了借鑒。