網絡藥理學聯合臨床探討接骨七厘膠囊對腰椎骨折的療效及作用機制

馮 莉 商 勛 趙小超 徐 盛 李 進

江蘇省宿遷市中醫院藥學部，江蘇宿遷 223800

接骨七厘膠囊（JGQLC）由大黃、當歸、骨碎補、硼砂、乳香、沒藥、血竭、土鱉蟲和自然銅9味中藥組成，被《國家基本藥物目錄·基層醫療衛生機構配備使用部分》收錄記載，具有活血祛瘀、接骨止痛的功效。JGQLC還具有抗炎，促進骨折愈合的作用[1-2]。腰椎骨折臨床較為常見，主要通過椎板切除減壓，對脊柱內固定進行治療，腰椎骨折患者后期伴隨許多并發癥，發展復雜，致殘率較高[3]，嚴重影響患者的生活質量。本研究通過臨床病例回顧性分析JGQLC對腰椎骨折的療效，網絡藥理學預測其對腰椎骨折的作用靶點及通路，討論分析其作用機制，為進一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取宿遷市中醫院骨科2020年6月至2021年8月收治的腰椎骨折術后患者63例進行回顧性分析研究，按用藥情況分為兩組，單用復方骨肽注射液患者為對照組（n=27），聯合使用JGQLC為觀察組（n=36）。對照組男10例，女17例，年齡24～69歲，平均（48.87±13.08）歲，胸腰椎（L1～L2）骨折14例、腰椎（L3～L5）骨折13例。觀察組男17例，女19例，年齡22～68歲，平均（50.84±11.85）歲，胸腰椎（L1～L2）骨折21例、腰椎（L3～L5）骨折15例。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

納入標準：①影像檢查確診為L1～L5骨折且為初次腰椎骨折患者；②病例資料完整。排除標準：①不能遵從治療方案或有嚴重精神疾病者；②具有原發性免疫缺陷疾病者或休克、惡性心律失常者；③有惡性腫瘤者；④對本研究藥物過敏者；⑤處于孕期或哺乳期者；⑥合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙者。

1.2 方法

對照組術后愈合采用復方骨肽注射液（智同生物制藥，國藥準字H20052314，批號：22101042）靜脈滴注，每次150 mg溶于250 ml 0.9%氯化鈉注射液中，1次/d。觀察組在對照組基礎上聯合口服JGQLC（金沙藥業，國藥準字Z20053999，批號：211202），2 次 /d，2 片 /次，治療 20 d。

1.3 觀察指標及評價標準

①臨床療效判定標準[4-5]，治愈：疼痛消失、外形及功能基本恢復，骨折處愈合良好；顯效：有輕微疼痛，外形及功能恢復欠佳，臨床癥狀基本好轉，骨折處愈合較好；無效：臨床癥狀仍存在，骨折處畸形或不愈合。總有效率=（治愈+顯效）例數/總例數×100%；②檢查骨代謝指標，采用羅氏CobasE601系統測定患者治療前后空腹狀態下血清中鈣、堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）指標水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料以 [n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

1.5 藥物-疾病間靶點預測及相互作用分析

通過 TCMSP（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM（http: //bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）檢索JGQLC活性成分及靶點基因，條件為OB≥ 30%、DL≥ 0.18。經 DrugBank（https: //go.drugbank.com/）將化合物結構與靶點再次確認。利用UniProt（http: //beta.uniprot.org/）檢索，選擇“Homo sapiens”，剔除不符合條件、非人源的靶點，得到JGQLC的基因靶點。通過Gene Cards（https: //auth.lifemapsc.com/）和 OMIM（https: //www.omim.org/）檢索腰椎骨折基因靶點，Venny 2.1.0軟件獲得交集靶點。將交集靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化處理，構建藥物-疾病-靶點網絡關系圖。

1.6 藥物-靶點蛋白相互作用關系及核心靶點篩選

將交集靶點基因復制到String PPI 11.0軟件，以人為研究對象，設置條件為mendium confidence＞0.9，剔除游離蛋白靶點，構建蛋白相互作用PPI網絡。將獲取的所有蛋白利用Cytoscape 3.7.1軟件、CytoNCA插件對該網絡進行拓撲分析，以度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）的值表示重要節點，值越大，節點越大，相互作用的靶點就越多，說明該網絡存在關鍵節點。輸入關鍵節點的參數值繪制成三線表，再將重要的靶點和化合物導入Cytoscape 3.7.1中完善顏色并調整節點大小構建拓撲網絡圖。

1.7 GO功能富集與KEGG通路分析

利用 Bioconductor軟件，借助 clusterprofiler、pathview、Dose包，通過R語言獲得基因本體及通路富集數據并可視化，進行GO功能富集和KEGG通路分析，獲得JGQLC在腰椎骨折中的關鍵性通路。

2 結果

2.1 兩組臨床療效比較

2.1.1 兩組總有效率比較 觀察組總有效率為97.22%，高于對照組的88.89%，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表 1。

表1 兩組總有效率比較[n（%）]

2.1.2 兩組骨代謝指標水平比較 治療前兩組鈣、堿性磷酸酶、β-CTX水平比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。治療后兩組鈣、β-CTX水平高于治療前，堿性磷酸酶水平低于治療前，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。治療后觀察組鈣水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），觀察組堿性磷酸酶水平低于對照組，β-CTX水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表 2。

表2 兩組骨代謝指標水平比較（）

表2 兩組骨代謝指標水平比較（）

注 β-CTX：Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列

組別 n 鈣（mmol/L） 堿性磷酸酶（U/L） β-CTX（ng/ml）治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 36 2.28±0.102.31±0.094.9080.000 87.72±5.19 67.63±4.37 66.285 0.000 93.49±5.39 130.95±6.56 126.7720.000對照組 27 2.29±0.092.30±0.078.0390.000 89.37±4.78 71.78±6.18 38.818 0.000 94.02±3.35 126.00±5.20 93.946 0.000 t值 0.391 0.476 2.632 -5.009 1.299 5.247 P值 0.699 0.638 0.098 0.000 0.204 0.000

2.2 藥物-疾病間靶點預測及相互作用分析

共篩選出91個活性較高成分，大黃16個、當歸2個、骨碎補18個、沒藥39個、乳香8個、土鱉蟲1個、血竭6個、自然銅1個。通過Venny 2.1.0軟件獲得藥物-疾病交集靶點216個，Cytoscape構建藥物-疾病-靶點網絡關系并進行拓撲學分析，見圖1。長方形代表疾病靶點，圓形代表有效成分。數圖結合分析的JGQLC針對腰椎骨折靶點孕酮受體（PGR）、前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）、重組人視網酸X受體α（RXRA）、雄激素受體（AR）、細胞色素氧化酶基因（CYP1A1）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90α家族A類成員 1（HSP90AA1）、白介素 -13（IL-13）、白介素 -1B（IL-1B）、氧化氮合酶（NOS2）等，預測JGQLC可能通過調控以上基因靶點對腰椎骨折發揮治療作用。

圖1 藥物-疾病-靶點關系圖

2.3 藥物-靶點蛋白相互作用關系及核心靶點篩選

將交集基因導入String PPI 11.0數據庫，來源選擇Homo sapiens得到蛋白相互作用網絡圖，見圖2。同時將交集基因導入Cytoscape 3.7.1軟件，獲得216個節點和4158條邊（圖3），設置條件DC≥29、BC≥66.46、CC≥0.51和EC≥0.04、LAC≥16.74，篩選出標黃的75個靶點，繼續設置條件BC≥15.46、CC≥0.74、DC≥48、EC≥0.11、LAC≥37.54，篩選標黃的核心靶點31個。預測JGQLC可能通過以上核心靶點對腰椎骨折發揮治療作用。已有文獻報道過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、ESR1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、蘇氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、長應答蛋白 2（EGR2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）靶點與骨折存在相關性。

圖2 蛋白相互作用網絡圖

圖3 篩選核心靶點過程圖

2.4 GO功能富集和KEGG通路分析

GO-BP共有2900個條目，設置P-value＜0.01，取校正P值前10的條目，主要涉及類固醇代謝過程、抗生素的反應、細胞對藥物的反應、金屬離子的響應、氧化應激的反應等。GO-CC共有68個條目，主要涉及質膜筏、內質網內腔、核染色質、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、核轉錄因子復合物等（圖6）。GO-MF共有173個條目，主要與脫氧核糖核酸-結合轉錄激活活性/特殊的RNA聚合酶Ⅱ、四吡咯結合、血紅素結合、類固醇結合、轉錄因子活性等緊密關聯。KEGG通路分析見圖7，主要涉及脂質與動脈粥樣硬化、白介素-17（IL-17）信號通路、PI3K-Akt信號通、MAPK信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖6 GO功能富集分析

3 討論

中醫認為血循環于脈中，運行不息，濡養全身。骨折后，必傷血，故有“跌打損傷之癥，專從血論”之說。活血祛瘀，續筋接骨是腰椎骨折的治療原則，JGQLC以土鱉蟲為君藥，破瘀血，續筋骨，以骨碎補接骨續筋、活血療傷，當歸養血活血，血竭活血散瘀止痛為臣藥，佐以大黃、沒藥、乳香活血散瘀，自然銅續筋接骨，硼砂消腫止痛，合眾藥之力，發揮續筋接骨療傷、活血止痛之功效。臨床證明，JGQLC對腰椎骨折有一定的促進愈合作用，可減少臨床并發癥[6]。

通過臨床與網絡藥理學相結合的方法探討JGQLC對腰椎骨折的療效及機制，獲得關鍵靶點、核心蛋白以及信號通路等重要信息。其中多個靶點、蛋白、信號通路已有研究證明與骨折存在一定關系。如通過調控雌激素受體α基因（ESR1）PvuII（C/T）和XbaI（A/G）多態性可降低骨折風險[7]。Jana等[8]發現過氧化物酶體增殖物激活受體γ與骨質疏松癥的發病機制有關，可降低老年人的骨折風險。另有研究表明，骨折的愈合與血清因子、血管內皮生長因子、骨形態發生蛋白2、胰島素樣生長因子1、轉化生長因子β密切相關[9-10]。

GO分析顯示，JGQLC治療腰椎骨折主要涉及類固醇代謝過程、類固醇激素的反應、脂多糖的反應。吳昊[11]發現細菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信號通路，進而干擾成骨細胞正常的分化功能。王顯威等[12]發現地塞米松（類固醇藥物）對大鼠下頜骨折的愈合具有延緩作用。KEGG分析顯示IL-17、AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK 和腫瘤壞死因子等信號通路與腰椎骨折密切相關。研究發現激活PI3K-Akt通路可促進骨折愈合，激活MAPK通路可促進成骨細胞增殖，影響細胞骨架結構[13-14]，李文鋒[15]發現NBD多肽通過與NEMO結合改善腫瘤壞死因子對成骨細胞的抑制作用。

綜上所述，JGQLC對腰椎骨折的愈合具有促進作用，大數據分析提示其作用機制與多個信號通路及核心靶點有關，為今后進一步深入研究提供參考依據。