添加氮源和金屬離子提高深黃傘形霉利用麩皮水解液積累油脂的研究

馮愛博，周化嵐，GULTOM Sarman Oktovianus，張建國*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)與工程研究所，上海，200093) 2(Department of Agricultural and Biosystems Engineering，Papua University Manokwari，Papua Barat，Indonesia)

利用霉菌、酵母菌、細菌以及藻類等富油微生物積累脂肪酸油脂是發(fā)展生物能源的重要方向[1]。而且，微生物脂肪酸富含多不飽和脂肪酸，具有營養(yǎng)保健功能[2-3]。例如，二十碳五烯酸可預(yù)防心血管等多種疾病[4]；γ-亞麻酸作為化妝品成分可延緩衰老[5]。因此，利用富油微生物積累油脂的研究已是近年來的熱點[6-7]。深黃傘形霉是一種著名的富油微生物，其油脂含量可高達86%[8]。深黃傘形霉在積累脂肪酸油脂方面受到廣泛關(guān)注[9-10]。GAO等[11]通過硅酸鎂顆粒調(diào)控深黃傘形霉形態(tài)結(jié)構(gòu)，也影響油脂分布，游離分散菌絲體的油脂含量較高。MEEUWSE等[12]建立了深黃傘形霉在液態(tài)培養(yǎng)時的生長和油脂積累模型，深黃傘形霉在碳源和氮源充足時為指數(shù)生長期，氮源耗盡時有利于油脂積累。但是，李卓婷等[13]研究表明發(fā)酵初期加入氮源有利于深黃傘形霉生長和油脂積累。且添加Fe3+、酵母提取液或Mg2+不僅能進一步促進油脂積累[14]，還能降低深黃傘形霉在葡萄糖耗盡時油脂被降解的速度。金屬離子會影響菌體內(nèi)酶的活性[15]，從而影響油脂合成途徑和積累。麩皮是一種富含淀粉、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等組分的生物質(zhì)資源[13]，其中淀粉、纖維素等糖類組分占比超過50%[14]。麩皮比秸稈等生物質(zhì)更易被利用。麩皮已經(jīng)被應(yīng)用于微生物生產(chǎn)乳酸[15]、乙醇[16]等物質(zhì)。麩皮水解液已經(jīng)被成功用于培養(yǎng)深黃傘形霉，積累油脂達9.87 g/L，菌體中油脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為39.35%。總糖利用率為69.40%，殘余糖中84.3%為多聚糖[16]。本研究探討氮源和金屬離子對深黃傘形霉利用麩皮水解液積累油脂的影響，為進一步利用麩皮和油脂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小麥麩皮水解液根據(jù)文獻[16]制備。化學(xué)試劑購買自國藥化學(xué)試劑有限公司。

儀器：Waters 1525高效液相色譜系統(tǒng)、Athena C18色譜柱，Waters公司；7890A氣質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent Technologies公司；ML104/02分析天平，梅特勒公司；HVE-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 添加氮源對深黃傘形霉積累油脂的影響

為初步比較添加氮源對深黃傘形霉積累油脂的影響，首先向麩皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L。250 mL搖瓶中裝100 mL麩皮水解液，分別添加1 g/L氮元素相當(dāng)質(zhì)量的硫酸銨、尿素、檸檬酸銨、醋酸銨后，接種孢子至終濃度為2×106CFU/mL，27 ℃，160 r/min培養(yǎng)5 d后測定生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)菨舛取８鶕?jù)實驗結(jié)果研究不同濃度的2種氮源對深黃傘形霉積累油脂的影響。向麩皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L，250 mL搖瓶中裝100 mL麩皮水解液，分別添加相當(dāng)于0.5、1.0、1.5、3.0 g/L氮元素的硫酸銨，相當(dāng)于0.5、1.0、1.5、3.0 g/L氮元素的乙酸銨后，接種孢子至終濃度為2×106CFU/mL，27 ℃，160 r/min培養(yǎng)5 d后測定生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)菨舛取?/p>

1.3 不同金屬離子對深黃傘形霉積累油脂的影響

向麩皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L。250 mL搖瓶中裝100 mL麩皮水解液分別添加CaCl2至質(zhì)量濃度依次為0.2、0.5、1.0、1.5 g/L；添加MgSO4至質(zhì)量濃度依次為0.5、1.0、1.5、2.0 g/L；添加ZnSO4至質(zhì)量濃度依次為0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L，添加MnSO4至質(zhì)量濃度依次為4.0、8.0、12.0、16.0 μg/L，接種孢子至終濃度為2×106CFU/mL，27 ℃，160 r/min培養(yǎng)5 d后測定生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)菨舛取?/p>

1.4 殘?zhí)菨舛鹊臏y定

吸取適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液1 mL，與1 mL苯酚溶液(體積分?jǐn)?shù)5%)充分混合，加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，室溫放置20 min后在470 nm測定吸光度值。根據(jù)以葡萄糖為標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖的含量。

1.5 生物量測定

濾紙在70 ℃烘箱烘干12 h并編號，稱質(zhì)量。將菌液用濾紙抽濾后在70 ℃烘干至質(zhì)量恒定。帶菌體的濾紙與濾紙之間的質(zhì)量差為生物量。

1.6 油脂含量的測定

取烘干后深黃傘形霉菌體100 mg，加入10 mL配制好的氯仿：甲醇(體積比2∶1)有機溶劑，180 r/min振蕩16 h。加入2.5 mL去離子水并搖勻1 min，再4 500 r/min離心10 min，取上層液體經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，經(jīng)吹氮氣去除氯仿，得到油脂后稱質(zhì)量。

1.7 脂肪酸組分的測定

取100 mg油脂與10 mL氯仿∶甲醇∶濃硫酸的混合物(體積比5∶4.25∶0.75)混合、搖勻，90 ℃水浴90 min后加入2.5 mL去離子水，振蕩1 min，以4 500 r/min離心15 min。取上層液體與3 mL氯仿混合，振蕩1 min，4 500 r/min離心15 min。將2次所得氯仿層混勻過濾用于GC-MS分析(Agilent 19091S-433)，毛細管色譜柱(HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm)。升溫程序為初始溫度60 ℃，以15 ℃/min的速度升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min。載氣為1 mL/min氦氣，壓力56.75 kPa。進樣量1 μL；分流比 10∶1。質(zhì)譜部分電子轟擊離子源的電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃。圖譜采集方式為全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z為20～550。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對深黃傘形霉利用麩皮水解液積累油脂的影響

如圖1-a和圖1-b所示，添加乙酸銨使深黃傘形霉的生物量和油脂含量分別由21.5 g/L和8.8 g/L 提高到25.8 g/L和10.0 g/L，促進了深黃傘形霉的生長和油脂產(chǎn)量。硫酸銨的添加對深黃傘形霉的生長和油脂產(chǎn)量的抑制不顯著，但是檸檬酸銨和尿素的添加顯著抑制深黃傘形霉在麩皮水解液的生長和油脂產(chǎn)量。這說明添加硫酸銨促進了深黃傘形霉的代謝，而添加檸檬酸銨和尿素則抑制了深黃傘形霉的代謝，這在圖1-c的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度也得到證實。添加乙酸銨時的殘?zhí)橇糠謩e為14.1 g/L，明顯低于對照組的24.7 g/L。添加檸檬酸銨和尿素時的殘?zhí)橇糠謩e為41.5 g/L和49.6 g/L，明顯高于對照組。

a-生物量；b-油脂產(chǎn)量；c-殘?zhí)琴|(zhì)量濃度圖1 氮源對深黃傘形霉利用麩皮水解液積累油脂的影響Fig.1 Effects of nitrogen sources addition on lipid production of Umbelopsis isabellina

進一步探討了乙酸銨和硫酸銨對深黃傘形霉生長和油脂積累的影響。當(dāng)乙酸銨添加量為1.5 g/L(氮元素當(dāng)量，下同)時，深黃傘形霉的生物量達到最大25.8 g/L(圖2-a)。但是油脂產(chǎn)量在乙酸銨添加量為1 g/L為最佳，比對照組提高11%(圖2-b)。油脂產(chǎn)量和生物量不同步，且添加不同量乙酸銨對殘?zhí)琴|(zhì)量濃度影響不明顯(圖2-c)。

a-生物量；b-油脂產(chǎn)量；c-殘?zhí)琴|(zhì)量濃度圖2 不同濃度乙酸銨對深黃傘形霉發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ammonium acetate on U.isabellina fermentation

圖3為添加不同濃度的硫酸銨對深黃傘形霉利用麩皮水解液生長和油脂積累的影響。深黃傘形霉的生物量在添加不同硫酸銨量時沒有顯著變化(圖3-a)，油脂產(chǎn)量隨硫酸銨添加量的增加呈現(xiàn)下降趨勢(圖3-b)。添加硫酸銨時殘?zhí)琴|(zhì)量濃度比對照組顯著降低。但是，殘?zhí)菨舛仍诓煌蛩徜@添加量時的差別也不顯著(圖3-c)。因此，在麩皮水解液中添加硫酸銨雖然能顯著提高深黃傘形霉對碳源的代謝，但沒有提高碳源到生物量和油脂的轉(zhuǎn)化。

a-生物量；b-油脂產(chǎn)量；c-殘?zhí)琴|(zhì)量濃度圖3 不同濃度硫酸銨對深黃傘形霉發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ammonium sulfate on U.isabellina fermentation

乙酸銨提高深黃傘形霉生物量和油脂產(chǎn)量可能由于乙酸銨的乙酸根作為碳源補充，或者乙酸根通過反應(yīng)(CH3COOH+CoASH+ATP→CH3CO-SCoA+H2O+AMP+PPi)活化成乙酰輔酶A，促進了三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。另外，乙酸輔酶A是合成脂肪酸的前體，因此添加乙酸銨促進脂肪酸積累[16]。

2.2 不同金屬離子對深黃傘形霉利用麩皮水解液積累油脂的影響

由圖4-a可知這4種金屬離子對深黃傘形霉生物量的影響不明顯。

a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+圖4 金屬離子對深黃傘形霉生物量的影響Fig.4 Effects of metal ions on the biomass of U.isabellina

圖5-a、圖5-b、圖5-d顯示不同濃度Ca2+、Mg2+、Mn2+時油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)鐘型趨勢。油脂產(chǎn)量分別在添加0.5 g/L CaCl2、1 g/L MgSO4和4 μg/L MnSO4時有最大值，分別為13.8、16.4、33.7 g/L。但是，隨著Zn2+濃度增加，雖然油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢，但仍低于對照組的油脂產(chǎn)量(圖5-c)。

a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+圖5 金屬離子對深黃傘形霉的油脂產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of metal ions on lipid yield of U.isabellina

圖6表明添加4種金屬離子時的殘?zhí)菨舛染陀趯φ战M的殘?zhí)菨舛龋謩e在1.0 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、0.5 mg/L ZnSO4和16 μg/L MnSO4時殘?zhí)菨舛葹閷φ战M的62.8%、60.5%、78.9%、65.1%。這說明適當(dāng)添加Ca2+、Mg2+和Mn2+促進深黃傘形霉的代謝。但是Zn2+的添加促進的糖代謝沒有轉(zhuǎn)化為油脂的積累。

a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+圖6 金屬離子對深黃傘形霉利用碳源的影響Fig.6 Effects of metal ions on carbon source utilization by U.isabellina

深黃傘形霉中油脂含量見圖7。不同濃度Ca2+、Mg2+、Mn2+時油脂產(chǎn)量呈現(xiàn)鐘型趨勢，分別在0.5 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、8 μg/L MnSO4時有最高油脂含量，分別達到49%、62%、47%(圖7-a、7-b、7-d)。但是，隨著Zn2+濃度增加，雖然油脂含量呈現(xiàn)上升趨勢，但仍低于對照組的油脂含量(圖7-c)。

a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+圖7 金屬離子對深黃傘形霉中油脂含量的影響Fig.7 Effects of metal ions on lipid content of U.isabellina

2.3 深黃傘形霉油脂成分分析

深黃傘形霉的油脂采用GC-MS分析，然后對比質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行化合物定性，再結(jié)合氣相色譜實現(xiàn)定量分析。深黃傘形霉油脂主要含肉豆蔻酸(0.72%)、棕櫚油酸、棕櫚酸(22.10%)、γ-亞麻酸(4.50%)、亞油酸(8.67%)、油酸(44.48%)、硬脂酸(6.45%)、花生酸(0.64%)等。其中，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別占47.45% 和13.61%。

3 討論與結(jié)論

將麩皮水解后培養(yǎng)深黃傘形霉進行油脂積累有利于促進食品廢棄物的高值化利用。深黃傘形霉能積累高含量的油脂。基于前期研究，本研究探討添加氮源和金屬離子提高深黃傘形霉利用麩皮水解液，積累油脂影響其代謝過程和油脂積累。結(jié)果表明當(dāng)乙酸銨添加量為1.5 g/L(氮元素當(dāng)量，下同)時，深黃傘形霉的生物量達到最大。乙酸銨添加量為1.0 g/L時，油脂產(chǎn)量達到最大較對照組提高11%，殘?zhí)抢寐室蔡岣吡?0.3%。添加Mg2+、Ca2+、Zn2+和Mn2+能顯著影響深黃傘形霉發(fā)酵情況，其中，Mg2+、Ca2+和Mn2+促進深黃傘形霉代謝碳源，促進脂肪合成。添加0.5 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、8 μg/L MnSO4時油脂產(chǎn)量提高，脂肪酸分別達到13.8、10.26、12.91 g/L，分別提高了39.8%、65.8%、30.8%。金屬離子對深黃傘形霉生長和積累油脂的影響主要因為金屬離子對菌體內(nèi)酶活性的調(diào)控，影響了其代謝過程和油脂積累[17]。表1總結(jié)了目前關(guān)于4種金屬離子影響微生物的方式。例如，Mg2+是丙酮酸脫羧酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶等的輔助因子，直接參與呼吸作用、糖酵解、氧化磷酸化等過程，具有重要調(diào)節(jié)作用。Ca2+促進ADP 磷酸化為ATP，增加細胞中能量的生成，提高生物量，激活α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶，促進深黃傘形霉的油脂合成代謝[18]。低濃度Mn2+會增加酰基輔酶A合成酶和酰基激酶的活性，使流向脂肪合成途徑的乙酰輔酶A增多，增加油脂積累[19]。

表1 金屬離子對微生物代謝的影響Table 1 Effects of metal ions on microbial metabolism