互助縣牦牛病毒性腹瀉病檢驗(yàn)以及鑒定

陶延慶

青海省海東市互助縣畜牧獸醫(yī)站，青海海東 810500

BVDV作為一種單股正鏈的RNA病毒，屬黃病毒科，瘟病毒屬，與豬瘟病毒和綿羊邊界病毒同屬[1]。BVDV主要感染動物為牛，也對羊、豬、鹿等動物有感染力[2]。根據(jù)BVDV感染細(xì)胞后是否會產(chǎn)生病變，BVDV可以分為細(xì)胞病變型(CP)和非細(xì)胞病變型(NCP)。根據(jù)5’UTR可以將病毒分為2個基因型，BVDV-1型，BVDV-2型。我國存在多個基因亞型，且目前我國主要流行的基因型為BVDV-1b型。該類疾病在全世界范圍內(nèi)流行十分廣泛，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。這種疾病可以導(dǎo)致母牛出現(xiàn)流產(chǎn)，胎兒發(fā)育不健康，腹瀉等一系列癥狀。如孕牛患有該病會引起下一代的牛犢出現(xiàn)持續(xù)性感染，持續(xù)性感染的動物終身攜帶病毒，且血清學(xué)結(jié)果為陰性，不斷地污染周圍的環(huán)境，造成病毒的擴(kuò)散[3]。這樣的傳播模式也使得BVDV的防治十分的困難，本試驗(yàn)通過對腹瀉的牦牛進(jìn)行ELISA抗體檢測，PCR鑒定對疾病進(jìn)行鑒定，為了更好的防治互助縣牦牛疾病做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病動物情況

互助縣某牦牛養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的兩頭持續(xù)腹瀉的牦牛，該養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的牦牛均未接種BVDV疫苗。

1.1.2 樣本采集采集兩頭發(fā)病牦牛的血清2 mL進(jìn)行ELISA檢測并命名為1、2，糞樣與血清樣本命名一致。

1.1.3 試劑

BVDV ELISA抗體檢測試劑盒購自愛德士生物制品有限公司。RNA提取試劑盒購自北京天根生物制品有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑以及PCR試劑均購自北京康為世紀(jì)有限公司。

1.1.4 引物

BVDV引物根據(jù)張國華等[4]的文章中方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工有限公司進(jìn)行合成。引物名稱，引物序列以及片段大小見表1。

表1 BVDV 5’UTR引物

1.2 方法

1.2.1 BVDV ELISA檢測

BVDV抗體ELISA檢測方法按照愛德士生物制品有限公司提供的說明書進(jìn)行操作，并根據(jù)說明書判讀檢測結(jié)果。

1.2.2 PCR鑒定

2例糞便樣本按照天根RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取出兩例樣本，測定RNA濃度后，使用北京康為世紀(jì)的試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作程序以及體系按照張國華文章[4]中的步驟進(jìn)行操作，獲得PCR產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析。

1.2.3 測序

將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GENEBANK數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果

2例血清樣本按照愛德士生物制品有限公司生產(chǎn)的BVDV抗體ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，陰性對照孔、陽性對照孔符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1號、2號樣本ELISA檢測結(jié)果顯示為陽性。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

取1號、2號糞便樣本，進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)率，5’UTR PCR鑒定，擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示陰性對照無條帶，1號、2號樣本擴(kuò)增出條帶為279 bp的特異性條帶（見圖1），將擴(kuò)增片段的測序結(jié)果在GENEBANK上進(jìn)行對比結(jié)果顯示與美國SD-1株同源性分別為95.7%、96.2%，顯示這兩例BVDV為BVDV-1型。

3 討論

牛病毒性腹瀉病在我國以及全世界范圍內(nèi)發(fā)生感染的情況已經(jīng)十分廣泛，尤其是對于我國畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的省份影響更加巨大[5，6]。2015年蔡元慶等人[7]對新疆部分地區(qū)的174份疑似BVDV感染樣本進(jìn)行了檢測，將檢測到的陽性樣本接種于MDBK細(xì)胞中可以使細(xì)胞發(fā)生病變（CPE），并且擴(kuò)增出了5’UTR片段，結(jié)果證實(shí)分離到的病毒屬于BVDV-1型。2018年陳新諾[8]對于川藏地區(qū)的149份牦牛糞便樣本進(jìn)行了牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示陽性率為19.46%，其中西藏地區(qū)陽性檢出率為27.14%，四川地區(qū)陽性率為12.66%。2019～2020年間杞艷萍[9]對我國西部地區(qū)的17個奶牛場，1 234份樣本通過5’UTR片段進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示樣本總陽性率為7.2%，17個牛場中有14個牛場檢測到了陽性樣本。本試驗(yàn)對于互助縣某牦牛養(yǎng)殖戶的腹瀉牛進(jìn)行BVDV抗原ELISA檢測以及5’UTR片段進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示，兩例腹瀉牛均為BVDV感染陽性牛，且屬于BVDV-1型樣本。因此，在后續(xù)的養(yǎng)殖過程中需要加強(qiáng)防疫，做好對牦牛群的疫苗免疫至關(guān)重要。

據(jù)有關(guān)報(bào)道，西北地區(qū)流行過的BVDV-1型病毒[10]，有的5’UTR序列也是和美國的SD-1株同源性較高,隨著西北地區(qū)肉牛、牦牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，動物不斷地交易，引種可能很大程度上導(dǎo)致牛病毒性腹瀉病的流行，造成經(jīng)濟(jì)損失。BVDV是危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展最為重要的病原之一。近年，由于跨國家、地區(qū)引種的增加及跨區(qū)域調(diào)運(yùn)的頻繁，我國多個地區(qū)發(fā)現(xiàn)了BVDV流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，有必要加大對新型毒株的監(jiān)測和預(yù)警。目前，通過分子手段檢測病毒，并對其進(jìn)行分離的鑒定，可以更加準(zhǔn)確的診斷BVDV。

本研究在兩例腹瀉牛糞便中分離到了BVDV-1型病毒，為互助縣牦牛對牛病毒性腹瀉疾病的防控提供了很好的理論依據(jù)，為本地區(qū)對于BVDV如何更好的防控，以及后續(xù)的研究方向提供了指導(dǎo)以及參考。牛病毒性腹瀉目前有多個基因型，目前市面上的疫苗比較單一，缺乏更加全面的疫苗對該類疾病進(jìn)行防控。當(dāng)發(fā)生疾病時主要還是要加強(qiáng)對病畜進(jìn)行隔離，對癥治療，不要盲目的使用抗生素類藥物，以免發(fā)生耐藥性。日常飼養(yǎng)中要加強(qiáng)對牦牛群體的日常管理，強(qiáng)化獸醫(yī)工作人員以及養(yǎng)殖戶對于牛病毒性腹瀉類疾病的了解和認(rèn)識，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖戶日常的養(yǎng)殖過程中要加強(qiáng)牛只進(jìn)出的管理，最好做到全進(jìn)全出，自繁自養(yǎng)的模式，如有必要進(jìn)行引種的情況下，要按照相關(guān)的規(guī)定做好檢測和隔離，確定引入的牛只無疫病的情況下才能混入牛群。科學(xué)的飼養(yǎng)模式可以增加養(yǎng)殖牦牛的收益，減少疾病的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失，讓養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)的道路上發(fā)展的越來越好。希望大家共同努力，為互助縣畜牧業(yè)美好的明天做出貢獻(xiàn)。