濃香型白酒糟醅細菌多樣性與窖齡關聯度的研究

胡 斌，羅明有，王 松，周瑞平，劉 江，付雨晴，唐代云，劉 超

（1.四川省宜賓市敘府酒業股份有限公司，四川宜賓 644600；2.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644600）

生產經驗和研究均表明通常情況下窖齡越長的窖池，原酒的產質量也越好。糟醅作為直接承載釀酒微生物生長繁殖的載體，對濃香型白酒的窖內發酵有著非常重要的影響，現有絕大部分研究都是圍繞窖齡與窖泥微生物多樣性的關系來進行的，對窖齡與其窖內糟醅微生物多樣性之間關聯度的研究不足。本次研究以宜賓產區某知名酒企3 口不同窖齡窖池發酵前后的糟醅為對象，深入探究不同窖齡窖池對發酵糟醅影響的差異和共性，為指導白酒生產提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

20 年窖齡窖池混合入窖及出窖糟醅，25 年份窖池混合入窖及出窖糟醅，36年份窖池混合入窖及出窖糟醅，儲存期6 個月以上的偏高溫大曲（粉碎后）。

1.2 試驗方法

1.2.1 糟醅樣品的處理及采集

分別選取20 年、25 年、36 年年份窖池中具有代表性且產質量穩定的窖池各1 口進行跟蹤采樣，選取的20 年份、25 年份、36 年份窖池窖號分別為5-3-11、3-3-13、2-2-8，按照宜賓產區五糧濃香型白酒生產工藝進行發酵，所有工藝參數無人為差異性調整（基本保持一致），共計取樣三個輪次，第一輪次為2020 年1 月份，分別對3 口實驗窖池入窖糟醅進行采樣，采樣分上中下3 層，每層使用五點取樣法取樣約1 kg 后均勻混合，取其中一部分進行理化檢測，另外一部分放置于-80 ℃超低溫冰箱保存待用；2020 年4 月份分別對該3 口實驗窖池按相同的采樣和封存方法對出窖糟醅及入窖糟醅進行采樣封存并檢測，此后依次為2020 年9 月（熱季放假45 d）對出窖及入窖糟醅進行采樣封存檢測，2020年12 月對第三輪次的出窖糟醅進行采樣封存。按窖齡分別將封存的3 個輪次的入窖及出窖糟醅混合均勻。

1.2.2 樣品編號

20年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實驗樣品編號分別為A1、A2，25 年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實驗樣品編號分別為B1、B2，36年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實驗樣品編號分別為C1、C2。

1.2.3 實驗樣品檢測

高通量測序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。糟醅酸、水、淀等理化指標參照文獻的方法進行檢測并取平均值分析。無線溫度傳感器對窖內上中下三層發酵溫度進行監測并取平均值。

2 結果和分析

2.1 實驗窖池發酵狀況概述

不同窖齡窖池發酵溫度及理化指標變化（表1）趨勢基本一致，該變化符合宜賓產區五糧濃香型白酒生產規律，判斷該三口實驗窖池均發酵正常（備注：由于入窖糟醅經過高溫蒸餾，部分還原糖已經轉化成焦糖等物質，不具備參考意義，因此在測定的時候不在對該指標進行測定）。

表1 糟醅在不同年份窖池發酵前后理化參數對比

2.2 不同樣品OTUs、多樣性指數

將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，在97 %的相似水平下進行生物信息統計分析，在OTU 聚類結果的基礎上，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列，共得到入窖細菌OTUs 數量1208 個，共有OTUs 數量257 個（圖1）；出窖細菌OTUs 數量1049 個，共有OTUs 數量32 個（圖2）。對比試驗糟醅樣品發酵前后Alpha 多樣性指數顯示，3 個試驗糟醅在發酵后細菌物種多樣性均大幅下降、物種豐度大幅上升，共有細菌OTUs 數量減少，結合生產實際分析，在發酵過程中缺氧、酸性的環境淘汰了大部分好氧型細菌，發酵過程中厭氧或兼性厭氧型細菌消耗窖內淀粉等營養物質大量繁殖，使得物種豐度大幅上升。不同窖齡出窖糟醅中共有的32 個細菌OTUs 可能為生產過程中的關鍵細菌，可從中選取具有代表性的功能性細菌進行研究。

圖1 濃香型入窖糟醅細菌韋恩圖

圖2 濃香型出窖糟醅細菌韋恩圖

2.3 Alpha多樣性指數計算（表2）

Coverage 指數為各樣品文庫的覆蓋率，數值越高，樣本中序列沒有被測出的概率越低。由表2 可知，所有樣品Coverage 指數均大于0.99，故本次測序結果可以代表樣本的真實情況。

2.4 Alpha多樣性指數分析

由表2 可以看出，不同窖齡窖池內糟醅發酵后，細菌物種多樣性均大幅減少，物種豐度均大幅增加，物種多樣性及物種豐度的整體變化趨勢基本一致，窖齡與糟醅發酵過程中細菌整體變化趨勢無明顯關聯。

表2 糟醅細菌的序列數、OTU數及Alpha多樣性指數

對比出窖糟醅細菌多樣性指數發現，36年窖池發酵糟醅物種多樣性最低，物種豐度最高，窖齡與出窖糟醅細菌物種多樣性成反比、與細菌物種豐度成正比。結合企業生產實際分析，窖齡越長的窖池在細菌組成結構上更優，能夠篩選掉更多與白酒產質量無關的細菌，從而擴大有益細菌的生存空間，進一步提高產質量。

2.5 基于屬水平的細菌群落分析

選取在屬水平上相對豐度前十的細菌屬制作百分比堆積柱形圖，見圖3，可以直觀地看到樣本優勢菌種的分類及占比情況，有利于發現濃香型出窖糟醅在屬水平上菌種組成的差異，為車間技改提供一定的理論基礎。

由圖3 可以看出，A2、B2、C2 中乳桿菌屬占比為81.45 %、95.84 %、97.41 %，均占據絕對優勢，隨著窖池年份的增加，乳桿菌屬的占比增加。韓興林等的研究表明，在濃香型白酒發酵后期主要產乳酸和乳酸乙酯，在實際生產過程中，可以通過人為調整窖期的方式達到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，進一步加強人為干預對白酒生產的影響。3 個不同年份窖池出窖糟醅中，除乳桿菌屬外含量最多且共有的細菌屬為假單胞菌屬，可對其分離純化后進行功能性分析。

圖3 濃香型出窖糟醅細菌屬水平結構分析

由圖3 可以看出，在20 年窖池糟醅中，檢出了多種25 年及36 年窖池出窖糟醅中未檢出的細菌菌屬；25 年窖池出窖糟醅中，檢出多種36 年窖池出窖糟醅未檢出的細菌菌屬；36年窖池出窖糟醅中檢出的細菌菌屬的種類數最少。結果顯示隨著窖齡增長，窖內發窖糟醅細菌組成結構更優，與Alpha 多樣性指數分析結論一致，在實際生產過程中，可根據出窖糟醅中檢出的細菌菌屬種類數在一定程度上判斷窖池的老熟程度。

3 結論

3.1 不同窖齡窖池糟醅發酵后，細菌物種多樣性大幅下降、物種豐度大幅上升，共有細菌OTUs 數量減少，物種多樣性及物種豐度的整體變化趨勢基本一致，窖齡與其糟醅發酵過程中細菌整體變化趨勢無明顯關聯。

3.2 窖池窖齡與出窖糟醅細菌物種多樣性成反比、細菌物種豐度成正比，窖齡越長的窖池在細菌組成結構上更優，能夠篩選掉更多與白酒產質量無關的細菌，從而擴大有益細菌的生存空間，進一步提高產質量。

3.3 在不同窖齡的出窖糟醅中，乳桿菌屬均占據絕對優勢，隨著窖池年份的增加，乳桿菌屬的占比與窖齡成正相關增加。在實際生產過程中，可以通過人為調整窖期的方式以達到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，進一步加強人為干預對白酒生產的影響。

3.4 在不同年份窖池出窖糟醅中，除乳桿菌屬外含量最多且共有的細菌屬為假單胞菌屬。

3.5 隨著窖齡增長，窖內發窖糟醅細菌組成結構更優，在實際生產過程中，可以根據出窖糟醅中檢出的細菌菌屬種類數在一定程度上判斷窖池的老熟程度，為技術指導生產實踐提供一定的理論依據。