基于高通量測序技術解析中高溫制曲細菌群落的演替規律

楊 勇，葛向陽，2，張龍云，李燕榮，賈亞偉

(1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800；2.宿遷學院，江蘇宿遷 223800)

作為中國傳統固態發酵蒸餾酒的重要物質保障，大曲具有糖化、發酵、生香等功能，直接決定了酒的風格及檔次。俗話說“曲定酒型”“曲乃酒之骨”，作為綿柔特色開創者的洋河綿柔型白酒，自然離不開制曲。作為一種富含多酶多菌的微生態制品，制曲過程中可培養微生物的消長及生化指標的變化規律已有研究，然而，大量微生物無法培養，傳統的培養方法只能在某一特定的培養條件下培養，條件單一，難以全面地反映微生物群落的多樣性及其結構組成。

隨著分子生物學的發展，基于免培養的高通量測序技術越來越廣泛地應用于微生物群落結構的解析中。蘇葛等利用高通量測序技術在不同大曲等級判定中進行了應用，揭示了洋河中高溫大曲獨特的微生物群落多樣性；吳樹坤利用高通量測序比較分析四川不同地區濃香型大曲的微生物群落結構，發現不同地區大曲的微生物多樣性存在差異；李靜心等采用高通量測序技術對白酒高溫大曲和中高溫大曲進行分析，比較了2 種大曲真菌結構的差異。目前對于大曲的研究多集中在成品曲的微生物群落結構，根據Li對不同工藝的中、低溫大曲的微生物群落變化的研究，發現在不同環境作用下，微生物群落結構會發生改變。

本試驗以中高溫大曲為研究對象，首次采用高通量測序技術對培菌發酵幾個主要階段的細菌群落進行分析，研究各階段優勢微生物的分布、豐度及其演替規律，為進一步剖析制曲發酵機理提供可靠的微生物信息。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

大曲樣品：中高溫大曲培養過程中入房（編號：RF，發酵0 d）、并房（編號：BF，發酵5 d）、上架（編號：SJ，發酵9 d）、大火（編號：DH，發酵15 d）、下架（編號：XJ，發酵21 d）、出房（編號：CF，發酵35 d）時各個階段的混合樣，分別粉碎、混勻、裝袋后，于-80 ℃保存備用。

儀器設備：Novaseq 6000 PE250 平臺、美國Bio-Rad Laboratory S1000型PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

使用MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit 進行基因組DNA 抽提后，利用Thermo NanoDrop One 檢測DNA的純度和濃度。

1.2.2 PCR擴增及產物電泳檢測

以基因組DNA 為模板，根據測序區域的選擇，使用帶barcode 的特異引物及TaKaRa Premix Taq? Version 2.0(TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China)進行PCR擴增。

1.2.2.1 引物對應區域

16S V4 區引物（515F 和806R）：鑒定細菌多樣性；擴增區域還包括：16S V3-V4/16S V4-V5；古菌16S V4-V5；功能基因對應引物等。

1.2.2.2 PCR反應體系(表1)

表1 PCR反應體系列表

1.2.2.3 PCR 反應條件

每個樣本進行3 個重復，并將同一樣本的PCR產物進行混合。

1.2.2.4 PCR 產物電泳檢測

用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物的片段長度和濃度，主帶長度在正常范圍內（例如16S V4：290-310 bp/16S V4-V5：400-450 bp 等）的樣品可用于進一步的實驗。

1.2.3 Pooling及切膠純化

利 用 GeneTools Analysis Software (Version4.03.05.0，SynGene)對PCR 產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR 產物進行混合。使用E.Z.N.-A.? Gel Extraction Kit(Omega，USA)凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

1.2.4 建庫及測序

按照NEBNext? Ultra?II DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標準流程進行建庫操作。使用Illumina Nova 6000 平臺對構建的擴增子文庫進行PE250 測序。

2 結果與分析

2.1 測序有效性分析

圖1 是以richness 指數來反映本實驗中不同培養階段大曲樣本的稀釋曲線，richness 指數常用來估計物種豐富度。本實驗對6 個不同培養階段的大曲進行測序，由圖1 可以看出，隨著測序深度的增加，richness 指數曲線都呈現先增加后逐步趨于平緩的趨勢，說明測序數據量漸進合理，本實驗各個樣本的測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數微生物的物種信息。

圖1 大曲培養各階段樣品的richness曲線

2.2 Alpha多樣性分析

OTU 是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為便于分析，通過歸類操作，將序列相似性大于等于97 %分歸為同一OTU。Chao1 和Ace 指數是用于計算群落豐度的指數，其值越大說明樣品中物種豐度越高。Simpson 指數是計算菌群多樣性的指數，其值越大說明群落多樣性越低。指數Coverage 用于表征各樣本文庫的覆蓋率，反映測序深度是否能覆蓋整個微生物群落，是否能代表樣本中所有微生物的真實情況。

由表2 可知，所有樣品的序列覆蓋度(coverage)均大于0.99，證明本次測序的結果能夠真實的反映所有樣本細菌微生物的菌群結構。中高溫大曲剛入房時，細菌豐度最低、菌群多樣性居中，說明通過自然接種的微生物數量有限；主發酵期，營養水分充足，環境適宜，細菌大量增殖，并房時細菌豐度與菌群多樣性都迅速升高，細菌豐度升至最高；進入潮火期，隨著曲心溫度進一步升高，常溫細菌逐漸不適應高溫環境而消亡，耐高溫細菌進一步生長繁殖，上架時細菌豐度開始降低但菌群多樣性升高；隨著曲心溫度保持60 ℃左右進入大火期，耐熱的芽孢桿菌逐漸開始占據優勢，淘汰大量不耐熱的細菌，細菌豐度開始升高但菌群多樣性降低；經過大火期的高溫馴化與淘汰，下架時的細菌豐度與菌群多樣性都較大火期降低；此后進入養曲期，曲心水分進一步降低，干燥缺水的環境逐漸不適合微生物的生長繁殖，出房時，細菌豐度進一步降低但菌群多樣性升至最高。

表2 大曲培養各階段樣品細菌Alpha多樣性指數

2.3 OTU分布Venn分析

對中高溫大曲不同培養階段獲取的細菌OTU進行統計分類，對不同樣品之間相對共有的以及獨有的OTU 數進行疊加，得出OTU 分布Venn 圖，比較OTU數目組成相似性及重疊情況。

如圖2 所示，細菌有19 個OTU 是中高溫大曲培養各階段所共有的，共有種群數量的占比達到23.18%～86.36%。就獨有的OTU 數而言，并房階段高達63，不僅遠高于共有OTU 數，也遠高于其他發酵階段，充分顯示了主發酵階段對菌群多樣性的的重要性；大火階段，獨有OTU 數為25；入房階段，獨有OTU 數為15；出房、上架與下架階段的獨有OTU數較少，相差不大。

圖2 大曲培養各階段OTUs交疊Venn圖

2.4 不同分類水平的物種變化

在了解每個OTU 對應的物種后，由于存在同一個物種具有多個不同的OTU 的情況。通過合并相同物種分類的OTU，從門、綱、目、科、屬不同分類水平，統計平均含量前15 的物種，其余的物種歸于others 中，根據百分比繪制細菌的分布柱狀圖，結果分別見圖3—圖6。

從圖3 中可以看出，在門與綱水平上，不同培養階段大曲中的細菌都是以厚壁菌門中的芽孢桿菌綱為主，占比64%以上，此外還有變形菌門中的變形菌綱，放線菌門中的放線菌綱。變形菌綱在入房時占比達到35 %，其他門與綱水平的細菌都很少，占比小于1 %。隨著發酵的進行，門與綱水平的細菌占比變化趨勢相同，芽孢桿菌綱所占比例呈先增加、后減少、而后波動變化的趨勢；變形菌綱呈先快速減少后緩慢增加的趨勢；放線菌綱則主要在大火期出現，占比7 %左右，而后先緩慢減少再緩慢增加。

圖3 大曲培養各階段細菌在門與綱水平上的分布變化

目水平上，如圖4 所示，從入房到大火階段，以芽孢桿菌綱中的乳桿菌目為主，此外還有少量的腸桿菌目、芽孢桿菌目、假諾卡氏菌目，其他目水平上的微生物占比都小于1%；乳桿菌目占比在64%～94%范圍之間先增長后下降，芽孢桿菌目則從入房時的不足1%緩慢增長至大火時的10%；腸桿菌目在入房時占比35%，而后快速下降，大火時回升至6%；放線菌綱中的假諾卡氏菌目僅在大火階段出現，占比5 %左右。下架至出房時，芽孢桿菌綱中的芽孢桿菌目與乳桿菌目變化劇烈，芽孢桿菌目下架時占比增長至74%，出房時又回落至33%；乳桿菌目下架時下降至16%，出房時回升至52%；假諾卡氏菌目先下降至2.8%后回升至3.2%；腸桿菌目保持緩慢下降趨勢，由5.7 %緩慢下降至4.5 %；出房時還有占比5.3%的放線菌綱未知目。

圖4 大曲培養各階段細菌在目水平上的分布變化

從科水平看，如圖5 所示，中高溫大曲以乳桿菌科、明串珠菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、葡萄球菌科為主。入房時以乳桿菌科、明串珠菌科、腸桿菌科為主，占比分別為46%、18%、35%；并房和上架時則以明串珠菌科與乳桿菌科為主，其中明串珠菌科先增長至58 %后緩落至28 %，乳桿菌科則先緩落至34 %后迅速增長至65 %，此外還出現葡萄球菌科，占比分別為3.4%、2.5%；大火期則以明串珠菌科為主，占比高達65 %，此外還有乳桿菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科、葡萄球菌科，占比分別為7.5 %、6.1 %、6.0 %、4.8 %、2.4 %；下架時則以芽孢桿菌科為主，占比高達72%，此外還有少量的明串珠菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科、乳桿菌科，占比分別為13.9%、5.7%、2.8%、2.0%；出房時微生物趨于均衡，主要以明串珠菌科、乳桿菌科、葡萄球菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科、偽諾卡氏菌科為主，占比分別為29.7 %、21.2 %、12.2 %、7.5%、4.5%、3.2%。

圖5 大曲培養各階段細菌在科水平上的分布變化

在屬分類水平上，結果如圖6。入房時以乳桿菌屬、腸桿菌科未知屬、魏斯氏菌屬為主，占比分別為46.11%、35.30%、16.59%；并房和上架時都以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬為主，并房時占比分別為27.95%、43.95%、14.33 %、6.35 %、3.42 %，上架時分別為56.52 %、21.68%、6.78%、8.63%、2.53%；大火期，乳桿菌屬大幅降低至6.84 %，魏斯氏菌屬則大幅增加至62.81 %，此外還有8.68 %的腸桿菌科、5.28 %的芽孢桿菌屬、2.65 %的明串珠菌屬、2.40 %的葡萄球菌屬、4.13%的糖多孢菌屬；下架時，芽孢桿菌屬占比大幅增長至71.16 %，魏斯氏菌屬大幅降低至11.46 %，此外還有3.75 %的腸桿菌科、2.46 %的明串珠菌屬、4.06 %的科薩克氏菌屬、2.44 %的糖多孢菌屬；出房時，各類微生物占比趨于均衡，以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬、克羅彭斯特菌屬、高溫放線菌屬為主，占比分別為14.33 %、24.02 %、6.05 %、5.64%、6.92%、12.15%、5.46%、7.10%，此外還有12.44%的腸桿菌科未知屬。

圖6 大曲培養各階段細菌在屬水平上的分布變化

2.5 OTU系統進化關系

在各分類水平（門、綱、目、科、屬及OTU）下，選取總體相對豐度排在前20 的序列，構建系統發育樹，結合樣本于各分類水平下相對豐度及物種注釋的可信度信息進行可視化展示，結果如圖7 和表3?？梢钥闯觯懈邷卮笄信琶?0 的物種大多為厚壁菌門芽孢桿菌綱水平下的乳桿菌目與芽孢桿菌目；就科水平而言，大多為乳桿菌目水平下的乳桿菌科與明串珠菌科，芽孢桿菌目水平下的芽孢桿菌科與葡萄球菌科；就屬水平而言，則是乳桿菌科水平下的乳桿菌屬與片球菌屬、明串珠菌科水平下的魏斯氏菌屬與明串珠菌屬、芽孢桿菌科水平下的芽孢桿菌屬、葡萄球菌科水平下的葡萄球菌屬。排名前10 的物種還有一個是變形菌門γ-變形菌綱腸桿菌目腸桿菌科。此外，由圖7 可以看出，中高溫大曲的細菌物種在培養各階段明顯不同，受生物與非生物因素的驅動，最終趨向于物種更加豐富、占比更加均衡。

表3 大曲培養各階段豐度排名前10的物種

圖7 大曲培養各階段細菌OTU進化關系

2.6 群落分布特征

通過PCoA 主坐標分析與豐度聚類熱圖研究中高溫制曲各階段細菌群落分布特征，結果如圖8和圖9所示。

結合圖8 和圖9 可知，大曲發酵各個階段細菌的菌群結構均存在一定差異，PCoA 分析顯示分布于四個象限，通過豐度聚類熱圖可將物種變化趨勢的類型分為五類。入房階段位于第一象限，上架階段位于第二象限，以乳桿菌屬、腸桿菌科、片球菌屬、鏈球菌屬構成的菌群（Ⅰ）主要在入房和上架階段；并房階段位于第三象限，以明串珠菌屬、假單胞菌屬為代表的菌群（Ⅱ）主要在并房階段；大火階段與出房階段在第三象限，二者距離較近，其中以魏斯氏菌屬、醋酸桿菌屬、糖多孢菌屬、鏈霉菌屬為代表的菌群（Ⅲ）主要在大火階段，以海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、乳球菌屬、高溫放線菌屬為代表的菌群（Ⅴ）主要在出房階段；下架階段位于第四象限，以芽孢桿菌屬和科薩克氏菌屬構成的菌群（Ⅳ）主要在下架階段。從圖9 也可以看出，變化趨勢相似的菌群在進化關系上遺傳距離也較為接近。

圖8 大曲培養各階段細菌主坐標分析圖

圖9 大曲培養各階段細菌群落豐度聚類熱圖

由圖8 可知，不同發酵階段樣品分布較為分散，其中入房、下架與其他階段距離較遠，表明這兩個階段的細菌菌群結構差異較大。因此，可將中高溫大曲的細菌群落結構演替分為四個階段：（1）大曲剛入房時，細菌群落主要來自于原輔料及環境中網羅的微生物；（2）并房至大火階段，伴隨溫濕度等環境因子的變化，大曲中水分營養充足，微生物結構不斷進行適應性調整；（3）下架后，經過高溫的長期馴化，大量不耐熱的微生物被淘汰，細菌群落結構變化巨大；（4）隨著品溫等環境漸趨溫和，微生物利用曲心殘留的水分和營養進行生長繁殖，細菌多樣性增加。

2.7 細菌群落與理化因子關聯分析

理化因子關聯分析后發現：二維排序軸RDA1和RDA2 解釋種群與理化的累計變化率分別為58.3 %和21.52 %，兩軸和為79.82 %（圖10），說明RDA1 和RDA2 能較好地反映大曲細菌群落與理化因子之間的內在關聯。各理化因子與群落結構的相關性大小依次為酸度、水分、酯化力、糖化力、發酵力，其中酸度和水分與細菌群落結構的關聯性較大，發酵力與細菌群落結構的關聯性較小，說明細菌群落主要受大曲酸度與水分的影響，發酵力則與細菌基本無關聯性。就主要優勢屬看，水分和糖化力與乳桿菌屬、腸桿菌正相關，說明這兩個菌屬對大曲水分和糖化力有較大影響；酸度則與魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬和葡萄球菌屬正相關，以葡萄球菌屬表現尤為顯著；酯化力與芽孢桿菌屬、科薩克氏菌屬、糖多孢菌屬、放線菌綱正相關，尤以放線菌綱表現尤為顯著。

圖10 理化因子與細菌優勢屬的RDA分析

3 總結與展望

3.1 總結

本研究首次采用高通量基因測序技術對大曲培養各階段細菌不同分類水平的組成與豐度進行了系統的研究，結果表明，中高溫大曲的優勢細菌為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬，都屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱水平下乳桿菌目與芽孢桿菌目的細菌種屬，此外還有變形菌門γ-變形菌綱腸桿菌目腸桿菌科。這些優勢細菌群落在張會敏、張倩、譚崇堯、王濤等的研究結果中也有所報道，種類和豐度有明顯差異，這是由于大曲是開放式生產、自然接種，原料、環境、工藝對大曲微生物區系均有直接影響。

各類優勢細菌的分布和豐度在發酵各階段具有明顯區別。大曲剛入房時，細菌豐度最低，菌群多樣性居中，種類以乳桿菌屬、腸桿菌科、魏斯氏菌屬為主；并房后，菌群多樣性提高，豐度升至最高，種類以魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬為主；上架后，豐度開始降低但菌群多樣性繼續升高，種類以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬為主；大火中期，豐度開始升高但菌群多樣性降低，種類以魏斯氏菌屬為主；下架后，菌群多樣性降至最低，豐度也降低，芽孢桿菌屬占據絕對優勢，兼有一定占比的魏斯氏菌屬；出房后，豐度進一步降低但菌群多樣性升至最高，以魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌科為主，還有占比5%以上的高溫放線菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅彭斯特菌屬，物種最趨豐富，占比更趨均衡。

此外，本研究還首次采用Venn 圖分析比較不同發酵階段OTU 數目組成相似性及重疊情況，從物種和樣本兩個層面對不同發酵階段OTU 進行聚類并繪制熱圖，選取總體相對豐度排在前20 的序列構建了OTU 進化圖，并通過PCoA 對不同發酵階段微生物結構的相似性與差異性進行了分析。結合大曲理化因子的關聯性分析，結果表明酸度和水分與細菌群落結構的關聯性較大，細菌種屬對大曲酶活也有一定的影響。

3.2 展望

高通量測序技術可以全面反映樣本中微生物的物種組成及豐度，為充分認識不可培養微生物并從完整的群落水平上研究微生物活動提供了可能，已成為微生物宏基因組學研究中的重要手段。高通量測序技術是以微生物DNA 作為檢測基礎，無法區分死菌與活菌，需要結合傳統純培養鑒定方法進行補充。

本試驗僅對中高溫大曲中的細菌群落演替進行了分析，需要結合真菌群落來分析中高溫大曲中微生物的演替規律，并結合眾多生物與非生物因素進行關聯性分析，如溫度、濕度、氧氣、門窗管控等，以全面準確地研究中高溫大曲微生態演變的內在驅動力。