現代酶工程技術及其在白酒釀造生產中的應用

岳騰飛，梁偉偉，李子森，關玉權，張志勇，薛錫佳，程 偉

（安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023）

中國白酒的釀造以高粱等谷物為原料，采用大曲、小曲或麩曲等為糖化發酵劑，經過復雜的酶化學反應、生化反應、有機化學反應及微生物代謝活動等發酵過程。原料本身的香味物質、酒曲微生物代謝產物、酒醅蒸餾產生的香氣物質及窖泥微生物代謝產生的香氣物質（部分香型的白酒使用窖泥發酵），共同形成了白酒復雜多樣的風味成分。釀酒微生物代謝產生的各類微生物酶在白酒制曲與發酵過程中起到重要作用，直接影響白酒的產量、風味特征及感官品質。酶工程是酶學與工程學融合的綜合性科學技術，是現代生物技術與未來生物經濟的重要支柱。近年來，隨著合成生物學的發展，作為合成生物學重要核心內容的酶工程研究逐漸受到重視與關注。

當前，白酒釀造生產中廣泛應用的工業酶制劑主要有糖化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶等，具有酶活力強、用量少、使用方便等優點，適量添加酶制劑可提高白酒的出酒率和感官品質。本文從酶工程技術及其發展，結合酶工程在白酒制曲、發酵、廢棄物處理等方面的應用，綜述了酶工程技術在白酒釀造生產中的應用及研究進展，并提出酶工程和白酒風味調控的研究前景及其對白酒定向風味調控的重要價值，對基于風味及代謝導向的白酒酶制劑產業化前景進行了展望，為提高原料利用率、改善白酒風味品質、實現綠色釀造等提供參考。

1 現代酶工程技術及其發展

酶是生物新陳代謝中非常重要的催化劑，近年來，酶工程技術越來越被人們所重視，多種類型的酶已實現工業化量產。酶和酸、堿或有機的催化劑相比，具有高效催化和專一性。酶是生物催化劑，具有如下特點：（1）所有的酶都是生物體產生的；（2）酶和生命活動密切相關，酶的化學本質是蛋白質，少數酶由RNA 構成；（3）酶的組成和分布是生物進化與組織功能分化的基礎；（4）酶能在各種水平上進行調節以適應生命活動的需要。

酶工程就是將酶或者微生物細胞、動植物細胞、細胞器等在生物反應裝置中，利用酶具有的生物催化功能，借助工程手段將相應的原料轉化成有用物質并應用于社會生活的科學技術。酶工程包括酶制劑的制備、酶的固定化、酶的修飾與改造及酶反應器等方面，應用主要集中在食品、輕工以及醫藥等領域。酶制劑在食品工業中主要應用于淀粉、乳品和果汁的加工以及烘烤食品和酒類發酵等領域，主要包括淀粉酶、葡萄糖異構酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等，還包括促進蛋白質消化的菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，促進纖維素消化的纖維素酶、聚糖酶等，促進乳糖消化的乳糖酶和促進脂肪消化的脂肪酶、酯酶等。

發酵工程根據生產流程被劃分為上游、中游和下游工程3個部分，如圖1所示。基因工程技術的出現推進了其他學科的迅速發展，國際和國內發酵工程進入到現代發酵工程階段。現代發酵工程技術在酶工程領域發揮著關鍵作用，典型發酵罐系統的應用為現代酶工程的產業化提供了必要條件，提高了酶制劑的工業化生產效率。20 世紀70 年代以后，伴隨著固定化酶（第三代酶）及其相關技術的產生，酶工程逐漸在化工醫藥、輕工食品、環境保護等領域發揮作用。當前，第三代酶主要包括輔助因子再生系統在內的固定化多酶系統，固定化基因工程菌、基因工程細胞技術等相關技術與連續生物反應器的結合，將促進發酵工業和化學合成工業的根本性變革。

圖1 現代發酵工藝組成示意圖

對酶進行改造和修飾是酶工程的重要內容，通過對酶蛋白分子的主鏈進行“切割”“剪切”以及在側鏈上進行化學修飾等改造，可以改善酶的物化性質和生物活性，甚至賦予酶新功能。酶作為特殊的蛋白質，可以通過蛋白質工程進行基因重組以改變或設計合成具有特定生物功能的酶，根據酶的結構和功能之間的關系，理性設計和改造活性位點，通過基因重組或其他手段改造酶，甚至創造具有新功能的酶，如圖2所示酶的人工設計。

圖2 依據蛋白質工程原理進行酶的人工設計

2 酶工程在酒曲生產中的應用

近年來，世界范圍內已經發現酶的數量多達幾千種。當前，酶工程技術產業得到了前所未有的發展，特別是在白酒發酵及配制酒等工藝中的運用與實踐，取得了較好的應用效果。白酒工業中，運用酶的種類主要包括蛋白質酶、纖維素酶、酯化酶、糖化酶、淀粉酶等多種類型，具體應用到的領域包括制曲、發酵、蒸糧及蒸酒、勾兌等，以及白酒的丟糟與廢水處理等方面。酶工程技術在改善白酒的品質口感、增加配制酒的主體風味成份、提高出酒率等方面發揮著重要作用。

2.1 產酶微生物的選育及應用

中國白酒的釀造屬于多菌種、開放式的釀造環境，釀酒微生物的群落結構及其代謝活動與產酶等是形成白酒風味特征的重要因素，微生物的代謝活動是酶的主要來源，圖3 所示為白酒主要微生物來源。高傳強等對芝麻香型白酒香味的形成進行了探究，發現霉菌是芝麻香型白酒生產過程中必不可少的糖化菌株，產酸產香能力較高，通過產生豐富的糖化酶、蛋白酶、液化酶等酶系降解淀粉、蛋白質等大分子物質，產生醇類、酯類以及多碳酸類等。馮曉山等在濃香型大曲中分離得到高產酯的紅曲霉，并應用于西鳳小麥曲的生產中，取得了較好的試驗效果。劉新宇等在汾酒清香型大曲中篩選到2 株酯化酶活較高的紅曲霉，通過培養條件優化后，其酯化酶活達到2.46 U，顯著高于普通清香型大曲。

圖3 中國白酒的釀造生產流程及主要微生物來源

自然微生物產生的天然酶具有酶活低等多種局限性，需要應用微生物篩選改良技術、基因工程、蛋白質工程(理性設計與定向進行)、代謝工程等多種酶工業微生物菌種技術以獲得高效酶制劑。酶工業微生物菌種須具備如下基本特征：（1）遺傳性狀穩定、重現性好、可反復傳代；（2）生長迅速、繁殖快、易培養；（3）高產量、高收率；（4）可長期保存、具有能經誘變產生變異或基因改造提升產酶能力的潛力。在不損傷微生物基本生命活動的前提下，采用物理、化學或生物學以及各種現代生物工程學方法，改變微生物的遺傳結構，打破其原有的代謝控制機制，進行目的產物（酶）的過量生產，有利于最終實現酶的產業化。發酵罐作為重要的生物反應器為微生物的生長繁殖提供適宜的環境，促進菌體生產人們需要的產物（如菌體、代謝酶等），典型發酵罐的設計與應用，尤其是大型發酵罐的應用為現代酶工程與發酵工程的產業化提供了重要關鍵設備，圖4所示為典型發酵罐系統示意圖。

圖4 典型發酵罐系統示意圖與實物圖

2.2 強化制曲

大曲在白酒釀造過程中起著糖化、發酵和生香的作用，大曲質量的優劣直接影響白酒的產量、質量和風格。大曲微生物菌群在白酒釀造過程中起著重要作用，是酒體質量與產量的重要保證，主要包含霉菌、細菌和酵母菌等微生物，其主要代謝酶包括糖化酶、酯化酶、蛋白酶、纖維素酶等。傳統大曲依靠環境微生物制成富含釀酒所需的菌系、酶系和物系等復合載體，形成并富含種類繁多的酒體呈香呈味物質。將傳統釀酒工藝和現代生物技術相結合，篩選和選育釀酒有益功能微生物，將該類功能微生物應用到白酒釀造過程中有助于提高原酒品質。目前，各白酒廠都在推廣應用強化大曲技術，將功能微生物應用到制曲中有利于提高酒曲的質量，圖5 所示為濃香型強化大曲生產工藝流程。

圖5 濃香型強化大曲生產工藝流程

韓英等基于風味和產酶性能，從清香型白酒酒醅中分離獲得1 株能賦予白酒醬香風格且產糖化酶能力較高的菌株M2，在優化條件下純種M2麩曲的糖化力達到917 U/g，該研究為該菌株強化發酵應用于清香型白酒生產中奠定了理論和應用基礎，也為白酒的可調控化、機械化和智能化的發展提供了菌種資源。張建良等從芝麻香大曲、糧醅和酒醅中分離出耐高溫酵母菌、乳酸菌和細菌，經馴化、純培養后按一定比例混合，用于綿柔型芝麻香大曲的強化制備，制曲溫度可以從傳統的62 ℃提高到65～70 ℃，為綿柔型芝麻香白酒典型風味物質和功能因子的形成奠定了生態基礎。杜禮泉等應用煙灰色紅曲霉制備麩曲，發現pH 值對麩曲的污染控制較為重要，當pH 值控制在4.3～4.8 時可以有效避免麩曲培養過程中的污染問題，酯化率達到35 %以上，采用黃水調整曲料的酸度明顯優于乳酸。

3 酶制劑在白酒固態發酵中的應用

白酒發酵過程中的酒醅微生物主要包括霉菌、細菌、酵母菌等三大類菌種屬。霉菌是糖化過程中產生糖化酶的主要菌種屬，包括曲霉、黑曲霉、黃曲霉、木霉、青霉等；細菌是產生蛋白酶、酯酶等特殊酶類的主要菌種屬，主要包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等；酵母菌是酒化作用的主要菌種屬，如酒精酵母、生香酵母、產朊假絲酵母等。

3.1 糖化酶的應用

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉從非還原性末端水解a-1,4 葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解a-1,6 葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖；糖化酶也能水解糊精、糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶是由曲霉優良菌種()經深層發酵提煉而成，在白酒等酒類釀造生產中，糖化酶的活力可以影響原料的分解糖化效率，進而影響白酒出酒率及某些風味物質的生成，具有控制高級醇生成等作用。申朝興的研究表明，使用活性干酵母和糖化酶代替部分大曲釀造白酒，可使平均出酒率達到55.85 %。羅惠波等的研究顯示，在酒醅中添加750 U/g 的糖化酶，可使白酒中高級醇的含量下降11.4%。

3.2 酯化酶的應用

酯類物質是多種白酒的重要香氣成分，含量的高低影響白酒的等級，其重要的合成途經是有機酸、乙醇在酯化酶的催化下進行的，酯化酶中的脂肪酶對白酒酯類化合物合成也具有重要的酶促催化作用。酯化酶的運用不僅能使各種合成酶發揮其組合作用，而且能夠在白酒發酵過程中提高酯類等風味物質的含量。在白酒釀造過程中，酸-醇非酶促自身酯化反應也是白酒酯類化合物形成的重要途徑；酯類物質的酯化反應還受到溫度、介質、時間、初始pH 值等因素的影響。綜上可知，白酒中酯類化合物的來源包括原料帶入，釀造和蒸餾過程緩慢的酯化反應及酶的酯化催化等3 種途徑（如圖6所示）。張獻敏等為解決濃香型白酒安全度夏問題，將多種有益微生物組合成多微曲應用于酒醅發酵過程中，試驗表明用多微曲調節酒醅發酵，優質率達47.9%，己酸乙酯含量達352.2 mg/100 mL，多微曲較好地解決了白酒釀造的安全度夏問題。

圖6 白酒釀造過程及其酯類化合物的合成途徑[23]

利用酶工程技術由紅曲霉發酵生產的酯化酶，應用于白酒釀造領域對我國白酒質量的提高、發展生態食品具有重要意義。紅曲霉菌與其他菌(產已酸梭狀芽孢桿菌、根霉和酸性曲霉菌等)混合可制成復合酯化酶生態菌劑，有利于強化傳統大曲的發酵功能和生香功能，使白酒的總酯含量達到優質酒水平；將紅曲霉菌制成的復合酯化酶生態菌劑直接混入糧糟進行發酵或雙輪底發酵，可縮短發酵周期并提高出酒率和優質酒率。目前應用的酯化酶制劑大多數仍屬于粗酶制劑且純度較低。因此，生產高純度及高酶活的商品酯化酶具有重要的應用價值，可以滿足釀酒企業提高濃香型白酒優質酒率的需求。

3.3 其他酶制劑的應用

在釀酒配料中，液態化型淀粉酶容易被原料淀粉所吸附，影響淀粉酶的液化活性，降低出酒率。酸性蛋白酶有利于將被吸附的淀粉酶從禁錮中釋放出來，重新發揮其液化作用；有利于酸性質蛋白酶與淀粉酶的充分融合，提高出酒率。在特定的酸性環境下，酸性蛋白酶是主要用于催化水解動物、植物蛋白質成分的酶制劑。在白酒釀造生產中適當添加酸性蛋白酶，可以改善白酒的獨特風味，有利于降低發酵過程中雜醇油的生成。李蘭在生料酒曲中添加2%～3%的酸性蛋白酶,應用于以大米、玉米和高粱等為原料的生料釀酒生產中,原料出酒率提高了1.84 %～2.68 %,并降低了生料酒中雜醇油的含量。Ogasawara 等研究發現木聚糖酶有助于提高大麥燒酒的發酵效率，增加酒精的產率，這可能是木聚糖酶對大麥細胞壁中木聚糖的分解有助于加快淀粉酶的作用。

白酒釀酒原料中的纖維素類物質含量較高，糧醅中添加纖維素酶及半纖維素酶有助于將釀酒原料中的纖維素類物質降解成糖類，發酵成酒精，從而提高原料的出酒率。糧醅中添加纖維素酶，還有利于破壞釀酒原料的細胞壁，使胞內物質游離出來以增強酶的催化效果，增加酒醅中的營養物質以有利于釀酒微生物的生長代謝。尚維等研究纖維素酶在清香型優質白酒中的應用，出酒率可提高13%，且不影響酒的感官品質。傅金泉在日本清酒生產中浸米時加入0.02 %～0.1 %的纖維素酶，浸泡17 h，米的溶解性好，糖化發酵順利，酒渣少，出酒率高。

4 酶制劑在釀酒廢棄物處理方面的應用

4.1 釀酒副產物的資源化利用

酒糟作為釀酒后的剩余產物，富含豐富的營養物質，非常適合進行飼料蛋白的生產。目前，酒糟的利用主要是直接作為動物飼料或微生物發酵后作為動物飼料，對其進行綜合利用的領域包括丟糟再發酵生產白酒、提取附加值產品、釀造食醋、培養食用菌、用作肥料、生產沼氣等。在常規生產方式下，難以充分利用酒糟中的各種營養物質。因此，有必要通過復合菌種的協同發酵，改善酒糟物質組成，提高酒糟中粗蛋白的含量，促進酒糟實現深度資源化利用。劉瑞娟等利用酒糟和玉米粉以及豆粕粉等作為原料，添加木聚糖酶、植酸酶和β-甘露聚糖酶等酶類，采用3 株枯草芽孢桿菌的混菌發酵處理，制備了富含多種酶的生物飼料，有效提升了酒糟飼料內實際蛋白和益生性物質的含量。

黃漿水是濃香型白酒窖內發酵過程中產生的主要液態副產物，含有豐富的風味（前體）物質，如醇、醛、酸和酯類等物質，還含有豐富的淀粉、還原糖、酵母自溶物等營養物質，以及大量經過長期馴化的釀造微生物菌體。當前，黃漿水主要用于人工窖泥培養、養窖護窖等，以及利用黃漿水蒸餾液提高原酒品質或生產新型白酒。酯化液是將黃漿水、有機酸、乙醇等成分通過酯化酶的作用轉化為酯類后的混合液，酯化液中富含以已酸乙酯為主的多種香味成分。采用酯化液與普通酒醅串蒸，可提高酒體中已酸乙酯的含量；將酯化液單獨蒸餾提純后可制成調味酒，有利于改善曲酒風味和提高曲酒質量。

4.2 釀酒廢水的凈化處理

白酒在釀造過程中會產生大量的工業廢水，其中的蒸餾底鍋水、釀造車間地面沖洗水、黃漿水等均含有大量的蛋白質、氨基酸等有機物，屬于高濃度廢水，需要綜合凈化處理達標后再排放。當前，環境凈化尤其是工業廢水和生活污水的凈化具有十分重要的現實意義，在現有的廢水凈化方法中，生物凈化是成本最低且最可行的。微生物的新陳代謝過程可以利用廢水中的某些有機物作為所需的營養來源。利用微生物體中酶的作用，可以將廢水中的部分有機物轉變成可利用的小分子物質，同時達到凈化廢水的目的。利用基因工程、酶工程等技術創造高效菌種，并利用固定化活微生物細胞技術實現菌種的固定化，在廢水處理及環境保護中發揮了重要作用并取得了積極成效。

Tao 等從濃香型老窖池中分離出一株命名為BPY5 的細菌菌株，該菌株可將乳酸發酵成丁酸鹽為主的代謝產物；接種BPY5 菌株后啤酒釀造廢水中乳酸的去除率顯著提高；表明BPY5 可用于工業生產丁酸或從含乳化廢水中回收丁酸。利用酶制劑進行污染物處理和環境監測，與其他生物法相比具有效率高、速度快、可靠性強等優點，酶制劑在環境保護中具有良好的應用前景，污水的生物酶處理是實施可持續發展和環境保護的重要的途徑。酶工程的發展可開發出更多價廉的新酶種，不斷提升酶工程技術手段，積極研究利用酶技術改造傳統工業，可降低生產過程中的污染水平。隨著固定化技術的進步，克服了游離酶的不穩定性，使酶可以反復和連續使用，利用酶處理難生物降解的化合物和低濃度廢水正成為污染治理領域的熱點。

5 總結與展望

近年來，隨著發酵工程、蛋白質工程、基因工程和計算機信息等技術的發展，酶工程技術得到了迅速發展和應用，工業用酶日益廣泛地應用于醫藥、農業、食品、能源及環保等多個行業。酶工程與發酵工程作為生物工程技術的重要組成部分，是生物技術產品實現產業化的橋梁和關鍵；酶制劑產業作為知識密集型高技術產業具有廣闊的發展空間。傳統白酒釀造主要依靠酒曲和酒醅中微生物代謝合成的大量酶類進行固態發酵，存在原料用量大、利用不充分、出酒率低等缺點，酶工程技術在白酒釀造生產中的應用具有重要意義。酶工程在白酒釀造中的應用還需要重視如下幾個方面的問題：利用酶的固定化技術發展復合酶,酶的回收與重復利用以及產業化成本的管控，產物與酶的分離及生產工藝的簡化，基于風味導向的產酶微生物選育及應用，改良釀酒酵母等產酶微生物以提高其生產性能，基于酶工程的白酒風味定向調控等。

從20 世紀90 年代開始，在白酒釀造生產的制曲、發酵、蒸餾勾兌和酒糟廢物利用等方面，酶制劑已逐漸得到廣泛應用。酶制劑對提高白酒釀造的出酒率、改善原酒質量、提高風味物質含量及保障白酒質量安全等方面具有重要影響，尤其是基于風味及代謝導向的白酒酶工程的產業化對白酒釀造產業具有重要價值，為實現白酒的綠色釀造提供了新途徑。白酒釀造體系是由大量微生物分泌的多種酶構成的復雜酶體系，酶制劑的添加和使用對白酒發酵體系的影響還需要深入研究，闡明白酒發酵過程中工業酶的應用與微生物菌系、發酵理化指標、代謝風味物質等的關聯，對定向調控白酒發酵指標具有重要的現實意義。