锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液細菌內毒素定量檢測

冀 紅，楊 旭

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

注射用亞錫亞甲基二膦酸鹽無菌粉末與99Mo-99mTc發生器配套使用，制備锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液(99mTc-MDP)。99mTc-MDP是目前公認的較理想骨顯像劑，通過化學吸附與骨骼無機成分中的羥基磷灰石結晶表面結合，在骨骼內沉積的多少受局部血流量和骨骼無機鹽代謝及成骨活血程度等因素的影響[1-3]。因此，當某些骨骼部位發生病理性改變時，如炎癥、腫瘤、骨折等，均可導致血供、代謝的變化，于相應部位呈現影像異常，從而對各種骨骼疾患提供診斷和定位依據。

細菌內毒素檢查法(BET)是利用鱟試劑檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判定供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法，已十分成熟。2020版《中國藥典》二部對99mTc-MDP的質量標準做出了明確規定，其中細菌內毒素限值<15 EU/mL[4-6]。細菌內毒素檢查方法包括凝膠法和光度法。凝膠法通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應進行限度檢測或半定量檢測內毒素，通過凝膠的堅實程度判斷檢測結果，具有操作簡單、容易掌握的優點，但實驗結果為定性、反應過程不可視、缺乏數據完整性。光度法是定量分析方法，光度測定法分為濁度法與顯色法。濁度法分為動態濁度法與終點濁度法；顯色法分為動態顯色法與終點顯色法。終點顯色法依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出顯色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量。動態顯色法是檢測反應混合物的吸光度或透光度達到某一預先設定的檢測值所需要的反應時間，或檢測值增加速度的方法。其原理是依據鱟試劑與內毒素發生反應，使用動態光度儀，利用反應時間與標準內毒素濃度關系的標準曲線，計算供試品的內毒素含量。其優點為檢驗范圍寬、靈敏度高、檢驗結果直觀準確，定量的檢測結果可用于產品的內毒素含量的趨勢分析，衡量產品的質量水平。凝膠法實驗因操作簡單易于推廣，在我國使用比較普遍[7-8]。

目前，隨著對藥品質量的要求越來越高，對檢測技術的要求也在不斷提高[9]。放射性藥品檢測有其特殊性，既要防止污染又要及時準確完成檢測工作。準確分析內毒素含量，不僅可以評估產品在生產過程中污染的相對風險，還可以分析產品的質量趨勢，起到風險預警的作用[10-12]。同時，細菌內毒素檢查所需的鱟試劑為海洋生物鱟的血液變形細胞溶胞的冷凍干燥品。凝膠法不同靈敏度的鱟試劑裝樣量一般為0.1 mg，加樣量是0.1 mL；光度動態法采用微量技術，加樣量是25 μL。因此，從保護鱟資源理念出發，在考量市場鱟試劑供應和使用量的同時，有必要建立準確、可靠的內毒素含量分析方法。本文對樣品溶解條件、干擾實驗、標準曲線可靠性實驗等進行研究，在相同條件下采用動態顯色法和凝膠法進行檢測，對比兩種檢測方法的實驗結果，建立99mTc-MDP光度動態顯色法測定內毒素含量的分析方法。

1 主要儀器與材料

光度測定儀：FC/ET型酶標分析儀，芬蘭Thermo(賽默飛)；試管恒溫儀：TAL-400，湛江安度斯生物有限公司。

動態顯色法(KCA)鱟試劑：規格0.01～10 EU/mL，0.35 mL/支，批號2004070；內毒素標準品：0.02～2.0 EU/mL，批號1907180；細菌內毒素檢查(BET)用水：5 mL/支，內毒素<0.003 EU/mL,批號2103120；凝膠法鱟試劑：規格0.1 mL/支，靈敏度0.5 EU/mL，批號2102192；細菌內毒素檢查微孔反應板：批號191018-594，細菌內毒素含量<0.005 EU/mL，無熱原空安瓿，移液器，無熱原吸頭。以上均為湛江安度斯生物科技有限公司產品。

2 實驗方法

動態顯色法光度測定在光度測定儀器中進行，溫度為(37± 1) ℃，反應時間60 min以保證顯色實驗的有效性，預先進行標準曲線的可靠性實驗以及供試品的干擾實驗，確定99mTc-MDP內毒素光度法的檢測方法；采用凝膠法和光度法檢驗同批號的99mTc-MDP，比較二者的實驗結果；取不同活度的供試品進行光度法檢測，研究99mTc-MDP放射性對光度動態顯色法的影響。

2.1 99mTc-MDP制備

在無菌操作條件下，依高锝[99mTc]酸鈉注射液的放射性濃度，取4 mL注入注射用亞細亞甲基二膦酸鹽瓶中，充分振搖，使凍干物溶解，靜止5 min，即得。

2.2 99mTc-MDP最大有效稀釋倍數

供試品的最大有效稀釋倍數MVD根據公式(1)進行計算：

MVD=CL/λ

(1)

式中：λ為標準曲線最低點濃度，0.02 EU/mL；C為供試品溶液濃度，按1 mL/mL；L為供試品的細菌內毒素限值，《中國藥典》規定99mTc-MDP細菌內毒素限值15 EU/mL。根據公式(1)計算出MVD=750倍。

2.3 標準曲線可靠性實驗(動態顯色法)

當使用新批號的鱟試劑或實驗條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性實驗。建立標準曲線包括梯度不大于10倍的至少三個標準內毒素濃度，每一濃度內毒素溶液(C溶液)至少平行3孔，陰性對照平行2孔。

2.3.1標準品制備 光度測定法專用工作標準品以0.46、0.73、0.75 mL細菌內毒素檢查用水溶解，旋渦混合60 s，制備2.0、0.2、0.02 EU/mL細菌內毒素標準溶液。按使用批次標準品要求進行復溶，附分析證書CoA的指示加水復溶安瓿內白色凍干粉。

2.3.2標準曲線可靠性實驗 將鱟試劑用0.35 mL BET水溶解，輕輕搖勻，使內容物充分溶解，避免產生氣泡。然后向微孔板里加入25 μL鱟試劑，陰性對照溶液(D溶液)再加入25 μL BET水，其他微孔加入25 μL內毒素溶液，具體按照表1標準曲線項目布板方式加樣。最后，設置實驗參數和反應項目。把反應板放置儀器中，反應時長60 min。

表1 標準曲線項目布板

2.4 干擾實驗

驗證在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有沒有干擾，從而確定檢驗供試品的制備方法(檢測濃度或稀釋倍數)。

根據《中國藥典》的細菌內毒素檢查法，實驗應設置4個反應項目，每種溶液2個平行。供試品溶液(A溶液)：用細菌內毒素檢查用水將99mTc-MDP注射液稀釋為30倍、60倍、90倍的溶液。供試品溶液(B溶液)：用A溶液0.73 mL復溶標示為0.2 EU/mL的工作標準品，得到99mTc-MDP注射液稀釋30倍、60倍、90倍的供試品溶液加入已知內毒素濃度0.2 EU/mL。內毒素標準溶液(C溶液)：方法同2.3.1節，制備標準曲線的內毒素標椎溶液，即2.0、0.2、0.02 EU/mL標準品溶液。陰性對照(D溶液)：細菌內毒素檢查用水。按項目布板在微孔板中先加25 μL以上溶液(表2)，順序為陰性、標準曲線、供試品溶液、供試品陽性溶液；然后加入25 μL鱟試劑。加樣完畢后，反應板放置儀器中，反應時長60 min。供試品當日檢驗后，將其放置24 h，即經過4個半衰期后，再檢測內毒素含量，對比兩次的檢驗結果。

表2 干擾實驗項目布板

2.5 動態顯色法檢測99mTc-MDP

根據干擾實驗結果，選擇無干擾的供試品濃度進行BET檢查。各反應濃度的制備反應項目設置與干擾實驗相同。選擇3批99mTc-MDP不同活度的供試品，進行動態顯色法定量檢測。采用凝膠法檢驗以上3批產品，比較二種檢驗方法的結果。

3 結果與討論

3.1 標準曲線可靠性實驗

標準曲線和回歸方程示于圖1。圖1數據結果顯示，陰性對照的吸光度反應時間(TNC)大于標準曲線最低點的反應時間，將全部數據進行線性回歸分析，標準曲線的相關系數(r)-1.000的絕對值大于0.980。即標準曲線范圍：2.0～0.02 EU/mL，TNC>Tλ，|r|≥0.980，CV<10%(參考值，CV=標椎偏差SD/平均值Mean*100%)，標準曲線符合規定。

圖1 標準曲線和回歸方程

3.2 干擾實驗

4批99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)用光度動態顯色法檢測內毒素含量的結果與放置24 h后內毒素含量的檢測結果列于表3。表3中四組實驗符合以下三個條件：(1) 系列溶液C的結果滿足“標椎曲線的可靠性實驗”中的要求；(2) 回收率R滿足：50%≤R≤200%；R=(CS-CT)/λm*100% ，CT供試品內毒素含量，CS含標準內毒素的供試品內毒素含量，λm為標準曲線的中點濃度0.2 EU/mL；(3) 陰性對照的反應時間λ大于標準曲線最低點的反應時間。

表3 不同批次99mTc-MDP在不同檢測濃度的回收率

3.3 確定有效稀釋倍數

99mTc-MDP供試品(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)稀釋30倍(S30)、60倍(S60)、90倍(S90)回收率趨勢比較示于圖2。均在最大有效稀釋倍數750內，對內毒素檢查光度測定動態顯色法，無干擾。確定99mTc-MDP細菌內毒素檢查可以采用光度動態顯色法。

圖2 不同批次不同稀釋倍數供試品回收率的比較

依據干擾實驗的回收率，四組S30回收率分別是103.30%、96.85%、108.53%、92.57%，回收率R滿足：50%≤R≤200%，對實驗沒有抑制和增強，即無干擾；符合《中國藥典》規定：取本品適量，用細菌內毒素檢查用水至少稀釋30倍后，依法檢查。供試品30倍的稀釋，步驟少，縮短實驗操作時間，同時不影響供試品中的內毒素生物活性。所以，通過干擾實驗，選定光度動態顯色法(微量技術)檢測99mTc-MDP的內毒素含量，并且選擇供試品原液稀釋30倍作為供試品溶液的日常檢測。

3.4 光度動態顯色法

四批次99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)光度動態法檢測結果，稀釋30 倍內毒素含量趨勢示于圖3。供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于《中國藥典》規定的內毒素限值，判定供試品符合規定。供試品99mTc-MDP (20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)內毒素檢測數據均<0.600 EU/mL，產品質量穩定。

圖3 不同批次99mTc-MDP稀釋30倍后內毒素的含量

3.5 99mTc-MDP不同活度的細菌內毒素定量檢查

選取3批99mTc-MDP供試品，批號為20211206-1-2、20211207-1-1、20211207-1-2初始活度分別為6.48、4.79、3.40 mCi，放置24、48、72 h。3批99mTc-MDP稀釋30倍后的供試品溶液用光度動態顯色法檢測內毒素含量，檢測結果列于表4。

表4 3批次不同活度99mTc-MDP在不同衰變時間的檢測結果

3批99mTc-MDP不同活度的供試品，在0、24、48、72 h檢驗數據顯示回收率均在80%～140%之間，符合《中國藥典》規定50%≤R≤200%；供試品內毒素含量均<0.600 EU/mL，符合《中國藥典》規定的每1 mL含內毒素含量<15 EU。實驗結果可以看出，不同活度的99mTc-MDP采用光度動態顯色法測定(定量檢測)的細菌內毒素含量沒有差異。放射性藥物99mTc-MDP對光度動態顯色法測定(定量檢測)的細菌內毒素含量無影響。

3批99mTc-MDP按《中國藥典》中的凝膠法進行細菌內毒素檢查，檢查結果每1 mL含內毒素的量<15 EU，與光度動態顯色法一致。

本實驗研究99mTc-MDP細菌內毒素的定量檢測，對于其他放射性示蹤劑如锝[99mTc]甲氧異腈注射液(99mTc-MIBI)、锝[99mTc]焦磷酸鹽注射液(99mTc-PYP)、锝[99mTc]雙半胱氨酸注射液(99mTc-EC)、锝[99mTc]雙半乙酯注射液(99mTc-ECD)、锝[99mTc]噴替酸鹽注射液(99mTc-DTPA)、锝[99mTc]聚合白蛋白注射液(99mTc-MAA)、锝[99mTc]植酸鹽注射液(99mTc-Phy)、锝[99mTc]依替菲寧注射液(99mTc-EHIDA)可以借鑒此方法，進行方法驗證。每一個品種藥典有記載其標準及限值，在2020版《中國藥典》中記載九種锝標記藥物，99mTc-MDP、99mTc-MIBI、99mTc-PYP、99mTc-EC、99mTc-DTPA、99mTc-MAA、99mTc-Phy、99mTc-EHIDA、99mTc-ECD，對細菌內毒素檢查要求一致(方法和限值)。不同品種溶液成分不同，其中的某些成分會對細菌內毒素檢查法產生干擾作用，所以需要排除干擾，通過干擾實驗，確定有效的稀釋倍數，進行光度法檢驗。實際檢驗中，光度法可以一次檢驗多個供試品(一個微孔板可以最多檢22個供試品)。為了提高藥品質量和用藥安全，依《中國藥典》的國家藥品標準，強化藥品的質量控制，緊跟國際先進檢測技術的發展趨勢。99mTc-MDP定量檢測方法對內毒素含量內控指標具有指導意義。通過建立99mTc-MDP的定量檢測方法，對其他放射性示蹤劑的細菌內毒素光度法的檢測技術有指導及支持作用。建立準確、可靠的99mTc-MDP內毒素定量分析方法十分必要。

綜上所述，本工作建立的光度動態顯色法鱟實驗靈敏度高，排除干擾的能力強；實驗操作方便快捷，檢測結果準確可靠。定量的檢測結果可用于產品內毒素含量的趨勢分析，有利于產品質量趨勢追蹤及在超過指標并導致產品不合格前識別和糾正偏差。當產品數據出現不穩定，雖在檢驗合格范圍內，但也要追溯產品生產工藝過程。光度動態顯色法檢測的范圍比凝膠法寬泛，使得有干擾的樣品可以有更多的稀釋空間，當部分凝膠法無法排除干擾的樣品時，可以選擇光度動態法。操作也相對簡單，尤其對于研究性的樣品，更具有優勢。

4 結論

按照《中國藥典》2020年版規定,99mTc-MDP內毒素含量應<15 EU/mL。使用FC/ET型酶標分析儀，選擇光度動態顯色微量技術法定量檢測99mTc-MDP的內毒素含量，快捷、簡便、準確，符合實驗數據完整性的要求。放射性藥物99mTc-MDP對光度動態顯色法測定的細菌內毒素含量無影響。新建立的99mTc-MDP光度動態顯色法可以定量檢測內毒素含量，是一種準確、可靠的細菌內毒素檢查方法。